本研究旨在探讨应用体外构建的人工神经网络样导管复合体移植治疗大鼠全横断脊髓损伤，观察这种治疗策略能否更好地促进受损伤脊髓运动功能的恢复，并分析其中可能的作用机制，为临床治疗急性脊髓损伤提供新策略及其实验依据。本研究共分为以下三个部分： 第一部分神经干细胞的体外培养、鉴定及其在三维空间PLGA生物材料中培养 目的：体外培养和鉴定所培养细胞为神经干细胞，并将其种植在三维空间PLGA材料中，继续体外培养一段时间，使PLGA材料内尽量分布足够多的细胞。 方法：选用SD乳鼠，取海马组织，机械吹打法培养NSCs，免疫荧光组织化学检测所培养细胞nestin的表达；将NSCs种植在4不同孔隙直径(0-75μm，75-125μm，125-200μm和200-300μm)，16通道PLGA材料中，分别培养7d和14d。Hoechst33324标记细胞，荧光镜下观察细胞在不同孔隙直径材料中的分布。MTT法检测不同孔隙直径PLGA材料内细胞的活性，间接反映其细胞的数量。扫描电镜下观察孔隙直径为200-300μm PLGA材料中所含细胞的形态特征。 结果：1.体外所培养细胞大部分为nestin阳性细胞。2.Hoechst33342荧光显示，培养7d时，细胞仍然成团贴附在材料的通道内，少有细胞迁移至PLGA材料内，而培养14d可见细胞较均匀的分布在材料内，同时观察到，孔隙直径为0-75μm和75-125μm两种PLGA材料，容纳细胞数较孔隙直径为125-200μm和200-300μm少。3.MTT结果显示，200-300μm孔隙直径的PLGA材料内细胞活性为各组最高，间接提示其内所含细胞数最多，而培养7d和14d两种培养方式对同种孔隙直径材料内所含细胞数并无影响。4.扫描电镜下，可见一个神经球贴附在材料通道内，大量的细胞从神经球中向PLGA材料内迁移，在材料内，可见细胞贴附在材料内并伸出突起，显示出PLGA材料良好生物相容性。 结论：采用机械培养法培养NSCs，体外能在短时间内培养出足够纯度和生长状态良好的NSCs；PLGA可降解生物材料能显示出良好生物相容性；体外培养NSCs于孔径为200-300μm的PLGA材料内14d，其存活细胞多且分布较均匀，更符合我们的实验要求。 第二部分：NT—3基因和NT—3受体基因修饰的神经干细胞在三维空间PLGA生物材料中混合培养构建人工神经网络样管道复合体 目的：在体外三维空间孔隙直径为200-300μm的PLGA材料中共培养转染了NT—3基因和TrkC基因的NSCs，促使这两种转基因的NSCs能够更多地分化为神经元样细胞，并具有突触形成潜能，并相互建立细胞连接，在体外构建一种具有功能的人工神经网络样管道复合体。 方法：应用各种MOI的Ad—GFP感染NSCs，48h后流式细胞仪检测NSCs的感染率，确定最适感染剂量。实验共分为6组：单纯NSCs组(单纯组)；Ad—LacZ—NSCs对照组(LacZ组)；Ad—TrkC—NSCs对照组(TrkC组)；Ad—NT—3-NSCs对照组(NT—3组)；Ad—NT—3-NSCs+ Ad—TrkC—NSCs联合组(联合组)；联合组+ K252a抑制组(抑制组)，将各组NSCs种植在孔隙直径为200-300μm的PLGA材料中，体外培养14d。运用免疫荧光组织化学检测各组Map2、GFAP和MOSP的表达；免疫荧光双标分别检测synapsin和PSD95的表达；利用细胞胞吞作用摄取FM1-43荧光染料与其突触小泡的膜表面结合，在高K+(50mmol/L)刺激下，激光共聚焦显微镜下观察单纯组和联合组FM1-43荧光颗粒的释放；同样在高K+刺激下，免疫荧光双标检测两组p—C—jun和βⅢ tubulin的表达；Western blot检测各组βⅢ tubulin和p—p38的表达；免疫荧光双标检测联合组Map2和4种神经递质ChAT、5-HT、Glutamate和GABA的表达；透射电镜观察单纯组和联合组PLGA材料内的细胞连接的超微结构。 结果：1.NSCs最适感染剂量为50 MOI。2.各组NSCs在PLGA材料内均可分化为神经元样细胞和神经胶质样细胞，与其它实验组相比，联合组表达Map2神经元样细胞比例最高(77.11％)，NT—3组次之，单纯组最低，Western blot检测βⅢ tubulin的表达也显示，联合组和NT—3组其蛋白含量较其他组高。3.synapsin和PSD95的表达显示，各组均有两种阳性细胞的表达，但联合组两种阳性细胞比例最高，在PLGA材料内形成丰富的细胞连接。4.激光共聚焦显微镜下观察到联合组有大量的FM1-43荧光颗粒的释放，并且其释放的强度随着时间的延长而逐渐减低；在高K+刺激下，联合组有大量表达p—C—jun和βⅢ tubulin的双重标记阳性细胞，而单纯组则未见其表达。5.联合组还检测到同时表达Map2和ChAT、5-HT、Glutamate和GABA神经递质的阳性细胞，但细胞数量少。6.Western blot检测p—p—38的表达显示，联合组其蛋白含量水平最高，抑制组最低。7.电镜下，可观察到单纯组分化为大量神经胶质样细胞，而联合组大量分化的神经元样细胞，其突起和突起间建立丰富的细胞连接，并且可见其形成突触样结构。 结论：利用携带NT—3基因和携带其受体基因TrkC的腺病毒分别转染NSCs，共培养种植在孔径为200-300μm的PLGA生物材料中构建出一种具有功能的人工神经网络样管道复合体。 第三部分：体外构建人工神经网络样导管复合体移植促进大鼠脊髓全横断损伤修复的研究 目的：探讨利用体外构建人工神经网络样导管复合体移植能否促进全横断脊髓损伤修复的研究。 方法：取成年雌性SD大鼠39只，随机分为7组，分别为：PLGA材料组(材料组)；单纯NSCs移植组(单纯组)；Ad—LacZ—NSCs移植组(LacZ组)；Ad—TrkC—NSCs移植组(TrkC组)；Ad—NT—3-NSCs移植组(NT—3组)；Ad—NT—3-NSCs+Ad—TrkC—NSCs移植组(联合组)；假手术组，各组神经干细胞在移植前分别用Hoechst33342进行标记。所有动物存活60d后，进行爬网格测验和BBB评分，在皮质体感区进行BDA顺行标记。术后74d，检测脊髓运动诱发电位(SCEP)和脊髓体感诱发电位(SSEP)。最后灌注固定动物，取材和切片并行形态学观察。 结果：1.行为学检测显示，各细胞移植组与材料组相比，能促进大鼠后肢运动功能的恢复，其中恢复最好的是联合组。2.电生理检测显示联合组SSEP和SCEP的峰峰值明显增大，但潜伏期仍然较长。3.中性红染色后计数发现，与实验对照组相比，联合组大脑皮质体感运动区内锥体细胞层、中脑红核、及脊髓L1背核存活神经元数目均显著增多，并有统计学意义。4.各细胞移植组在脊髓损伤处均检测到Map2、GFAP、MOSP、synaptophsin和PSD95染色阳性细胞，与其他细胞移植组相比，联合组Map2和PSD95阳性细胞比例最高。5.免疫荧光组织化学检测NF—200和GAP—43表达显示，与材料组相比，细胞移植组的脊髓横断处及附近，均可看到多少不等的NF—200和GAP—43阳性神经纤维，其中，联合组NF—200阳性神经纤维数量最多。6.各细胞移植组，只在联合组损伤区头端检测到少数BDA阳性神经纤维。7.基因修饰细胞移植到受损伤脊髓2个月后仍能表达外源基因产物(NT—3、TrkC和LacZ)。8.电镜下可见联合组的脊髓损伤区内有再生的有髓鞘神经纤维和突触样结构。 结论：体外构建人工神经网络样导管复合体移植到大鼠全横断脊髓损伤处，能够促进大鼠全横断脊髓损伤后功能的恢复。