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目的:约87%的脑卒中为缺血性脑卒中,静脉溶栓及血栓切除术是恢复脑组织血液供应的主要临床治疗策略。课题组前期探究了芪参益气方在脑缺血/再灌注损伤中的药效作用,但芪参益气方及益气、活血组分是否可以部分恢复脑组织血流供应,从而减少脑组织损伤的作用尚不明晰。芪参益气（Qi Shen Yi Qi,QSYQ）由君药黄芪,臣药丹参、三七及使药降香油组成。其中,黄芪为益气（Yi Qi,YQ）组分,丹参、三七构成活血（Huo Xue,HX）组分。本研究在实验室前期脑卒中的研究基础上,首次采用血栓法脑卒中急性期模型,以免疫系统与止血系统的互作为切入点探讨芪参益气全方及益气、活血组分的药效作用及关键作用机制。此外,我们在体外水平采用小鼠脑微血管内皮细胞（b End.3）氧糖剥夺/复氧（OGD/R）模型以及凝血酶诱导血小板-白细胞聚合体（Platelet-Leukocyte Aggregates,PLAs）模型,来模拟疾病发生发展的关键病理过程、验证体内实验结果,并探讨了益气、活血组分的协同/差异作用,以期为芪参益气方治疗血栓性脑卒中提供理论依据。方法:1.利用血栓法构建脑卒中急性期模型,即将预先在毛细管内形成的血栓经颈内动脉注射至大脑中动脉,以造成血栓栓塞性脑卒中,设置组别:假手术组、模型组、QSYQ组、YQ组、HX组。连续灌胃给予QSYQ、YQ、HX浸膏或生理盐水进行预保护一周,进行血栓法造模。24 h后,通过脑梗死体积、神经功能缺损评分、外周循环血涂片评价芪参益气方及益气、活血组分的药效作用。2.通过文献检索获取血小板-白细胞聚合体（PLAs）形成的关键蛋白,将血栓法脑卒中急性期模型的循环血液样本进行实时逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）,对脑组织进行免疫荧光法（IF）和免疫印迹法（WB）以考察PLAs形成的关键蛋白表达水平。此外,利用Fe Cl3颈动脉血栓模型,考察芪参益气全方及益气、活血组分是否具有抑制血栓形成作用。通过注射Anti-Ly6G消融体内循环白细胞,探究芪参益气方的抗血栓作用是否部分通过血小板-白细胞相互作用。设置组别:假手术组、模型组、Anti-Ly6G组、QSYQ组、YQ组、HX组,在造模前7天连续灌胃给予QSYQ、YQ、HX浸膏或生理盐水。Anti-Ly6G组在造模前24小时腹腔注射Anti-Ly6G抗体（10mg/kg）,其余组别腹腔注射Ig G2a同源对照（10mg/kg）。通过动态颈动脉血流、血管闭塞时间、最终血流量、循环白细胞数量、循环活化血小板比例来评价芪参益气方及益气、活血组分是否具有抑制血栓形成的作用。3.在体外,通过CCK8测定芪参益气方在b End.3细胞上的半数抑制浓度（IC50）。对b End.3进行细胞氧糖剥夺6小时,复氧24小时。复氧时加入药物,复氧结束后加入新鲜提取并染色标记的血小板或者白细胞,孵育结束后使用高内涵筛选系统（Operetta）检测黏附率。在体外血小板-白细胞黏附模型中,将血小板、白细胞及QSYQ或其组分共同孵育15分钟,加入激动剂凝血酶及抗体染料共孵育20分钟后,使用流式细胞术检测PLAs的形成以及关键蛋白CD62P/PSGL-1的表达水平。结果:1.血栓法造模24小时后,模型组大鼠脑梗死体积、神经功能缺损评分及外周血PLAs显著增加。QSYQ、YQ、HX组能够显著改善脑梗死体积、神经功能缺损评分,两组分协同发挥药效作用。QSYQ能够明显地降低PLAs数量,YQ、HX组均有降低PLAs数量的趋势。2.血栓法卒中大鼠外周血RT-PCR结果表明,QSYQ、YQ、HX组能够显著降低PLAs形成关键基因m RNA水平的表达,如MAC-1、PSGL-1、TLR2、CD40。脑组织IF结果表明,QSYQ组可以显著降低CD62P、PSGL-1的表达。WB结果进一步验证了QSYQ对PSGL-1的调节作用。其中,YQ组对于PSGL-1调节作用较活血组分突出,而HX组在CD62P的调节上优于益气组分,表明益气、活血组分在通过PLAs发挥的脑保护作用中可能存在差异作用。在Fe Cl3颈动脉血栓模型中,QSYQ、YQ、HX组均能显著延长血管闭塞时间、提高最终血流量,并显著降低Fe Cl3颈动脉血栓模型小鼠外周循环血液中的免疫细胞数量和血小板的活化状态,且不影响止血功能。3.CCK8结果显示0.1 mg/m L、0.25 mg/m L的QSYQ不影响脑内皮微血管细胞的活力,当QSYQ剂量增加至0.5 mg/m L及以上时,细胞活力被明显抑制,半数抑制浓度为0.6783 mg/m L。OGD/R模型细胞黏附实验结果表明,芪参益气方能够显著降低血小板或白细胞与内皮细胞的黏附,益气、活血组分作用弱于全方药效。在全方中,益气、活血组分具有加和的药效作用。流式细胞术结果显示,芪参益气全方及益气、活血组分可以显著减少PLAs的形成,QSYQ可以显著降低PLAs的CD62P、PSGL-1蛋白水平。YQ组在对PSGL-1调节作用中,存在更突出的药效贡献,进一步验证了体内实验的结果。结论:1.QSYQ可降低血栓法脑卒中损伤,有效改善脑梗死、神经功能。揭示并验证了CD62P/PSGL-1介导的PLAs形成是QSYQ减少血栓性脑卒中急性期大鼠脑损伤的关键机制。2.揭示了益气组分与活血组分潜在的协同/差异作用。由黄芪构成的益气组分侧重于对免疫系统白细胞PSGL-1受体的调节,而丹参、三七活血组分侧重于对血小板P-选择素功能的调节。