恶性肿瘤已经成为严重危害人类健康的重大公共卫生问题。在世界范围内,恶性肿瘤发病率与死亡率逐年增高。胃癌作为常见的消化系统恶性肿瘤之一,在我国的发病率位居第2位而死亡率位居第3位。最新数据显示黑色素瘤在我国的发病率为8/10万,虽然较低,但却呈现出成倍增长的趋势。尽管针对黑色素瘤以及胃癌的早期手术治疗与综合放化疗发展迅速,但黑色素瘤和胃癌患者的预后并不理想,其中胃癌的五年生存率仅为20%,黑色素瘤的五年生存率则更低。造成这一结局主要与肿瘤转移密切相关。肿瘤转移是多步骤的复杂过程,主要包括单个的肿瘤细胞从原发灶脱落,经过上皮-间质转化获得基质细胞特性后,侵袭基底膜及细胞外基质,渗入机体脉管系统并游走至远处器官,再向周围正常组织侵袭形成微转移灶,最后持续增殖形成临床可检测的转移灶。但原发灶中仅有极少部分的细胞能够最终形成肉眼可见的转移灶,因此可见,肿瘤异质性驱动肿瘤转移。肿瘤异质性的形成主要源于基因组的不稳定性,包括癌基因过度激活,以及抑癌基因突变失活。本研究尝试同时针对肿瘤细胞中癌基因和抑癌基因进行单独或联合干预,观察对肿瘤恶性生物学行为的影响,为发展针对多基因的肿瘤治疗策略提供科学依据。鼠双微体同源基因2(Mouse double minute-2 homolog,MDM2),是肿瘤研究领域最为活跃、功能最为强大的癌基因之一。MDM2发挥其生物学功能主要通过p53依赖以及非依赖的通路实现。其中,研究最为广泛的是p53依赖的通路,并依据MDM2与p53相互绑定的生物学特性,设计合成了小分子抑制剂Nutlin-3。但是,小分子抑制剂Nutlin-3发挥生物学功能需要依赖野生型p53的表达,而在人类所发生的肿瘤中,有一半的肿瘤存在p53的缺失或突变,这大大限制了 Nutlin-3向临床应用的转化。最近,有报道称,依据MDM2的蛋白分子结构设计合成的小分子抑制剂SP-141,能够直接作用于MDM2蛋白,促进其自身发生泛素化降解,可通过非依赖p53的信号通路抑制肿瘤的增殖和转移。癌基因的过度活化以及抑癌基因的低表达或突变失活对肿瘤的发生发展具有促进作用。JWA基因,又称ARL6ip5,是本课题组于1996年发现和克隆并一直致力于研究的新的环境应答基因,其编码细胞骨架结合蛋白。JWA具有活跃的生物学功能,能够抑制氧化应激、修复DNA损伤,除此之外,JWA还通过调节MAPK信号通路,抑制黑色素瘤、胃癌的血管生成与转移。对黑色素瘤和胃癌肿瘤人群研究发现,JWA在癌组织中的表达显著低于癌旁组织,癌组织中JWA蛋白表达低的患者预后明显较差。因此,在黑色素瘤及胃癌中,JWA发挥肿瘤抑癌基因的作用。本研究旨在从癌基因MDM2以及抑癌基因JWA两个角度入手,于黑色素瘤及胃癌体外水平上,观察MDM2的小分子抑制剂SP-141对黑色素瘤及胃癌细胞增殖、凋亡、迁移的影响及其分子机制,并联合增加JWA蛋白表达的措施,进一步观察联合处理后对黑色素瘤和胃癌细胞增殖、凋亡、迁移及相关分子机制的作用,为拓展SP-141以及JWA联合SP-141的潜在的临床应用价值提供学术依据。目的:研究MDM2的新型小分子抑制剂SP-141单独或联合干预JWA后对黑色素瘤细胞株A375和B16F10、胃癌细胞株MGC803和BGC823增殖、凋亡以及迁移的影响及其分子机制。方法:使用不同剂量的SP-141处理黑色素瘤细胞株A375和B16F10、胃癌细胞株MGC803和BGC823,或向这四株细胞中转染Flag-JWA质粒24 h后再经SP-141处理24h,采用CCK-8法、克隆形成实验、流式细胞术、Hoechst染色法、划痕实验分别检测细胞存活率、细胞增殖、周期分布、凋亡以及迁移能力改变。采用Western blot法检测凋亡及迁移的相关分子改变。结果:1、SP-141抑制黑色素瘤和胃癌细胞的增殖。通过CCK-8法检测细胞存活情况,发现SP-141使黑色素瘤细胞A375和B16F10,胃癌细胞MGC803和BGC823的存活率下降,且四株细胞对应的IC50值分别为0.41μM、0.52μM、0.62μM和0.60 μM。克隆形成实验发现对照组的A375、B16F10、MGC803和BGC823平均克隆形成数目分别为249.00±39.61个、244.33±17.10个、351.67±41.86个和426.00±13.12个,而0.5 μM SP-141处理后上述细胞平均克隆形成数目减少为11.00 ± 3.61个、10.00±2.00个、13.67 ± 4.72个和63.33±3.51个,数据显示SP-141显著抑制黑色素瘤和胃癌细胞的克隆形成,定量分析差异存在统计学意义(P<0.01)。2、SP-141使黑色素瘤和胃癌细胞周期阻滞在G2/M期。流式细胞法检测细胞周期分布,发现0.5μM剂量SP-141处理24 h后A375、B16F10、MGC803和BGC823在G2/M期的细胞分布比例分别增加至82.38±2.08%、49.72±4.77%,94.22±0.03%和93.00±1.29%,表明SP-141可以增加黑色素瘤细胞A375和B16F10,胃癌细胞MGC803和BGC823在G2/M期的周期分布,差异存在统计学意义(P<0.01)。3、SP-141诱导黑色素瘤和胃癌细胞凋亡。采用Hoechst染色实验发现SP-141显著增加A375、B16F10、MGC803和BGC823的凋亡发生率。流式细胞结果表明,经 0.5μM SP-141 处理后 24 h,A375、B16F10、MGC803 和 BGC823四株细胞发生凋亡的比例分别增加了 0.69±0.003倍、0.62±0.21倍、3.48 ±0.13倍和1.54±0.05倍,差异存在统计学意义(P<0.001),进一步支持SP-141促进黑色素瘤和胃癌细胞凋亡。Western blot检测结果显示SP-141降低抗凋亡Bcl-2蛋白表达,升高促凋亡蛋白Bax、Caspase-3剪切体、PARP1剪切体的蛋白表达。综上所述,SP-141通过线粒体途径促进黑色素瘤细胞和胃癌细胞的凋亡。4、SP-141抑制黑色素瘤细胞、胃癌细胞的迁移。细胞划痕实验显示,在黑色素瘤B16F10中,分别用DMSO、0.1 μM、0.2μM剂量的SP-141处理,12h的细胞迁移率由 32.33±2.52%降至 21.67±2.89%和 16.00±1.73%,24h 的细胞迁移率由66.00±3.61%降低至52.67±2.52%和30.00±10.00%。相似地,在胃癌细胞MGC803中,经相同剂量的SP-141处理后,12 h的细胞迁移率由21.67±2.89%降至 10.67±1.56%和 2.67±2.52%,24 h 的细胞迁移率由 42.67±2.52%降低至 31.00±1.73%和 12.00±2.00%,提示 SP-141 对 B16F10和MGC803细胞迁移的抑制作用存在剂量依赖性。Western blot检测发现FAK的蛋白表达随SP-141剂量的增加而下降。5、JWA蛋白与MDM2蛋白不存在相互调控关系。SP-141处理黑色素瘤A375和胃癌细胞MGC803,Western blot法检测MDM2的蛋白水平随SP-141浓度增加而降低,呈现剂量依赖关系,而JWA蛋白的表达水平不受SP-141影响。向黑色素瘤A375和胃癌细胞MGC803转染梯度升高的Flag-JWA质粒,Western blot实验显示JWA蛋白水平逐渐升高,而MDM2的蛋白表达水平不变。6、在黑色素瘤细胞B16F10、胃癌细胞MGC803和BGC823增殖方面,JWA联合SP-141组克隆形成个数依次为10.33±1.53个、40.33±4.40个和6.00±1.73个,而SP-141单独处理组克隆团形成个数分别为11.00±3.00个、41.67±2.08个和8.67±2.89个,两组差异无统计学意义(P>0.05),因此JWA联合SP-141未对细胞增殖显示出联合抑制效果。7、JWA联合SP-141部分诱导黑色素瘤细胞、胃癌细胞的凋亡。向黑色素瘤细胞A375和B16F10、胃癌细胞MGC803和BGC823中转染Flag-JWA质粒后,再经SP-141处理24 h,通过Western blot观察到抗凋亡蛋白Bcl-2表达均降低,促凋亡蛋白Bax、PARP1剪切体均升高,其中MGC803的Bax蛋白水平比基础水平升高了 8.20倍、Cleaved-PARP1升高了 5.50倍。8、JWA联合SP-141抑制黑色素瘤细胞、胃癌细胞的迁移。在黑色素瘤B16F10和胃癌细胞MGC803中,JWA联合SP-141组的细胞划痕宽度最大,在12 h时分别为90.00%和95.00%,在24 h时分别为85.00%和80.00%,且与单独转染Flag-JWA、单独SP-141处理之间的差异存在统计学意义(P<0.05)。Transwell迁移小室实验也显示联合处理组的穿膜细胞数最少,各组之间的差异均存在明显的统计学意义(P<0.001)。Western blot检测发现联合处理组FAK的蛋白表达量为对照组的20.00%～60.00%,且均低于单独处理组。结论:本研究首次证实MDM2的小分子抑制剂SP-141,可有效地抑制黑色素瘤和胃癌细胞的增殖、迁移并促进凋亡。同时,增加这两类肿瘤细胞中JWA蛋白表达水平,可抑制黑色素瘤和胃癌细胞的迁移,部分促进它们的凋亡;JWA与SP-141联合干预对黑色素瘤和胃癌细胞的迁移存在显著的联合抑制作用。从机制上探讨发现JWA联合SP-141下调关键下游节点分子FAK蛋白表达,发挥其对迁移的联合抑制作用。首次从抑癌基因JWA和癌基因MDM2两个方面入手,初步探索联合干预JWA和MDM2对黑色素瘤以及胃癌细胞多种恶性表型的作用。本研究成果提示干预JWA和MDM2这两个关键分子,具有预防和治疗黑色素瘤和胃癌转移的潜在的临床应用价值。