目的1.探讨si RNA沉默PCSK6基因对胶原诱导性关节炎(CIA)成纤维样滑膜细胞(FLS)生物学行为的影响。2.探讨外源性PCSK6重组蛋白对类风湿关节炎(RA)成纤维样滑膜细胞生物学行为的影响及其分子机制。方法1.采用牛Ⅱ型胶原诱导大鼠CIA模型,取膝关节滑膜组织原代培养FLS;采用人工合成的大鼠P CSK6特异si RNA特异性抑制PCSK6在CIA FLS中的表达,以negative si RNA为阴性对照组,瞬时转染24 h、36 h,采用RT-q PCR法检测抑制效率,同时检测PCSK6基因沉默后各相关基因的表达;采用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、ELISA等方法检测干扰PCSK6表达后对大鼠CIA FLS增殖、侵袭、迁移、细胞周期和相关炎性因子分泌的影响。2.采用PCSK6重组蛋白诱导RA FLS,采用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、E LISA等方法检测PCSK6重组蛋白对RA FLS增殖、侵袭、迁移、细胞周期和凋亡以及相关炎性因子分泌的影响;采用R T-q PCR法检测PCSK6重组蛋白刺激后各相关基因的表达;采用W estern blot法检测PCSK6重组蛋白对基质金属蛋白酶M MP9以及ERK、STAT3、Wnt3a、Nodal、m TOR、NF-κB p65、NF-κB p105/p50信号转导通路的影响。采用通路抑制剂P D98059、Stattic、PDTC分别抑制ERK、STAT3、NF-κB p65通路,与PCSK6重组蛋白共同作用于RA FLS,利用MTT、Transwell、细胞划痕、流式细胞术、E LISA等方法检测ERK、STAT3、NF-κB p65通路抑制剂对PCSK6重组蛋白诱导的R A FLS增殖、侵袭、迁移、细胞周期和凋亡以及相关炎性因子分泌的影响。结果1.转染特异性si RNA-PCSK6后,干扰组与阴性对照组相比,PCSK6 m RNA水平明显被抑制(P<0.001),CIA FLS的增殖受到抑制(P<0.001),细胞的侵袭和迁移能力下降(P<0.001),肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)分泌降低(P<0.001),G0/G1期的细胞数目增多(P<0.05),PCSK6下游基因CXCL9、MMP2、MMP9、NOSTRIN、HIF-1α、MPZL2、IGF2、PADI4表达均明显下降(P<0.05)。2.PCSK6重组蛋白诱导RA FLS后,与空白对照组相比,150ng/m L PCSK6重组蛋白促进效果最显著,能使RA FLS的增殖速率显著提高(P<0.01),细胞的迁移和侵袭能力加强(P<0.001),IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α分泌均升高(P<0.05),S期和G2/M期的细胞数增多(P<0.01),细胞晚期凋亡率减少(P<0.01),PCSK6下游基因C10ORF116、CXCL9、CXCL10、HIF-1α、IL-6、IL-10、IL-26、MMP9、NOSTRIN、TNF-α表达均明显升高(P<0.001),MMP9前体和成熟的蛋白量均升高,诱导6h时可显著激活FLS中的ERK、STAT3、NF-κB p65信号转导通路。加入通路抑制剂P D98059、Stattic和PDTC后,150ng/m L PCSK6重组蛋白诱导的R A FLS的增殖(P<0.05)、迁移(P<0.001)、侵袭(P<0.001)、炎性因子(IL-1α、IL-1β、IL-17、IL-6和TNF-α)分泌(P<0.05)均受到抑制;通路抑制剂Stattic和PDTC可以逆转PCSK6重组蛋白对细胞周期的诱导(P<0.05);通路抑制剂PDTC可以逆转PCSK6重组蛋白对F LS的细胞凋亡的影响(P<0.05)。结论1.内源性PCSK6基因沉默对CIA FLS的生物学行为具有一定抑制作用,为进一步研究C IA发病机制奠定基础。2.外源性PCSK6重组蛋白对RA FLS的增殖、迁移、侵袭和炎症因子分泌等生物学行为具有一定促进作用;P CSK6通过参与ERK、STAT3、NF-κB p65信号转导通路来调控RA FLS的生物学行为。PCSK6可以作为研究RA发病机制、药物筛选以及免疫治疗的新靶点。