肺孢子菌肺炎（Pneumocystis jirovecii pneumonia,PCP)是免疫功能低下人群尤其是艾滋病患者中最常见的机会性感染和最主要死亡原因之一，导致 PCP的病原体是耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii，PJ)，该病原体从1909以来一直被认为是原虫,但在1988年证实是一种介于子囊(真)菌亚门与担子(真)菌亚门之间的真核生物，为真菌家族的一员。临床诊断 PCP病例依靠临床表现，确诊需要发现 PJ的滋养体和/或包囊。然而，由于 PJ不能体外培养，一般采取染色方法进行诊断，但该方法阳性率低，操作繁琐费时，制约了 PCP的病原学诊断，容易造成误诊和漏诊。近年来，国外多项研究认为，聚合酶链反应（PCR）测序方法可以明显提高 PCP诊断的敏感性与特异性，可成为诊断的金标准之一，诊断目的基因以线粒体大亚基 rRNA　　(mtLSUrRNA)的敏感性和特异性最好。然而，国内有关研究鲜见报道，迄今仍缺乏统一的分子诊断标准。有研究证实，自然环境中和宿主感染的 PJ具有基因多态性，长期使用磺胺类药物可能导致耐药 PJ。最常用的分型序列是 mtLSUrRNA基因、rRNA基因内转录间隔区(ITS)、细胞色素 B（CYB)基因、二氢蝶酸合成酶(DHPS)基因及二氢蝶酸还原酶(DHFR)基因，而后三条基因还是药物作用靶点，可用于耐药位点监测。迄今为止，我国艾滋病患者 PJ感染的基因多态性仍是个谜，其潜在耐药位点也未明了。因此，本研究拟在我国南方地区艾滋病合并肺部感染患者中应用PCR方法，探讨其诊断 PCP的价值；同时，了解我国南方地区艾滋病合并 PCP患者 PJ感染的基因多态性、基因分型及潜在耐药位点。　　研究目的：　　1.探讨 PCR方法在诊断艾滋病合并 PCP中的价值，以提高 PCP的病原学诊断率。　　2.分析我南方地区艾滋病合并 PCP患者 PJ感染的基因多态性、基因分型及潜在耐药位点，以了解该地区艾滋病患者 PCP的分子流行病学特点。　　研究内容：　　1.收集2012年1月至2014年9月在我院收治的具有肺部感染的158例 AIDS患者临床资料，包括：性别、年龄、CD4细胞数值、有无使用过 HARRT治疗、有无使用磺胺类药物、是否为初次感染、预后情况等。以158例患者为入组对象，建立临床资料数据库。　　2.收集入组患者 BALF，提取 PJ-DNA后，将 PJ-mtLSU rRNA作为目的基因采用PCR方法进行扩增，成功扩增出 PJ-DNA并通过测序得到 mtLSU rRNA基因位点序列可诊断 PCP，统计采用PCR法诊断 PCP的例数得到检测率。结合本研究入组对象的临床资料以及 GMS染色的结果，并将确诊 PCP的患者作为研究对象，比较确诊 PCP患者均采用PCR法与 GMS染色法这两种诊断方法得到的结果，分析结果并总结 PCR作为 PCP的分子诊断方法的意义。　　3.基因多态性分析：针对PCR方法得到的PJ-mtLSU rRNA阳性标本，再进行4个基因的扩增。然后对5个基因产物（包括mtLSU rRNA基因、DHPS基因、DHPS基因、ITS基因、CYB基因）进行测序分析，确定各个基因分型。通过GenBank中原型序列比较有无新型序列的发现，本研究结果数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，两组定性资料的比较采用卡方检验（χ2 Test），P<0.05表示差异具有统计学意义。　　研究对象及研究方法：　　（1）研究对象：　　以2012年1月至2014年9月我院收治的具有肺部感染的158例 AIDS患者的肺泡灌洗液（BALF）作为研究对象，各种诊断参考本文研究方法的诊断标准。　　（2）研究方法　　1）收集研究对象的临床资料，建立临床资料的数据库。　　2）针对研究对象提取 PJ-DNA后运用PCR方法扩增目的基因 mtLSU rRNA，其中PCR能够扩增出 mtLSU rRNA基因的确定为 PCR诊断 PCP阳性。参考回顾性分析的临床资料得到临床诊断为 PCP的例数，同时对研究对象中采用GMS染色法诊断为 PCP的例数以及采用PCR测序法诊断为 PCP的例数进行统计。并以临床诊断+PCR测序/GMS染色法确诊 PCP的患者作为研究对象，采用PCR法与 GMS染色法两种方法检测确诊 PCP患者的检测率进行比较。　　3）对于成功扩增出 PJ-mtLSU rRNA的阳性标本，继续扩增 DHPS基因、DHPS基因、ITS基因、CYB基因这四个基因。然后结果去测序、对测序结果进行分析、将得到的分型与 Genbank里面的原型进行比对。　　4）本研究结果数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理，两组定性资料的比较用卡方检验（χ2 Test），P<0.05表示差异具有统计学意义。=　　研究结果：　　（1）在2012年1月至2014年9月期间收治在广州市第八人民医院的158例 AIDS合并肺部感染的患者中采用PCR方法成功检测出PJ例数有56例，占总例数的35.4％。结果表示 PCR方法诊断 PCP检测率为35.4%.　　（2）158例 AIDS合并肺炎患者中临床诊断 PCP的例数为51，占总例数的32.2%；GMS染色镜检诊断 PCP的例数31例，占总例数的19.6%；PCR诊断 PCP的例数56，占总例数的35.4%。将确诊为 PCP的51例标本作为研究对象，比较其运用PCR方法与 GMS染色镜检这两种方法得到的诊断 PCP的例数，同时比较这两种方法的敏感性，探讨 PCR方法运用于 PCP诊断的意义。经卡方检验得出结论是 PCR法的敏感性高于 GMS染色法（P=0.000）。　　（3）以mtLSU rRNA为目的基因扩增出的 PJ阳性例数有56例，比对 Genbank里面的原型序列，均符合原型在85、248的2个位点分型，一共分为5型，各型的比例分别是基因型1型占23%、基因型2型占23%、基因型3型占16%、基因型4型占34%、基因型5型占4%。没有发现新的基因型。　　（4）针对研究对象以DHFR、DHPS、ITS、CYB四个基因为目的基因继续采用PCR技术检测 PJ，以DHFR为目的基因成功扩增出38个 PJ阳性样本，通过与基因库的 PJ参考序列进行比对发现 DHFR具有多态性，当中12例样本在312位点是有混合 PJ株感染，1例在188位点有混合 PJ株感染，未发现新型基因型及耐药相关的位点突变。以DHPS为目的基因成功扩增出40个 PJ阳性样本，通过与基因库的 PJ参考序列进行比对发现 DHPS具有多态性，当中有3例在耐药相关位点163、169有发生碱基突变，其他均与原型一致，未发现新型基因。以ITS为目的基因成功扩增出53个 PJ阳性样本，获得53条 ITS1和53条 ITS序列，通过与基因库的 PJ参考序列进行比对获得 ITS1基因型8型（A、B、D、E、G、I、SYD、DELIr）和4条新序列；ITS2基因型7型（b、e、g、h、p、i、r）和4条新序列，一共获得14种组合序列，当中“BTM4g、BTM1i”是新发现的组合型，之前没有报道过；Eg是最常见的 ITS基因型；ITS基因比较复杂具有明显多态性。以CYB为目的基因成功扩增出51个 PJ阳性样本，通过与基因库的 PJ参考序列进行比对，发现与已知基因型相符的有44例，分别有 CYB1型25个、CYB2型13个、CYB5型2个、CYB8型4个，CYB10、CYB11、CYB12是本研究新发现的基因型，分别有4个、3个、1个，其中标本69是 CYB8型和新基因型的混合感染。　　（5）将获得的新基因型纳入 GenBank，获得登录号。扩大了我国用于 PJ分型的样本量，为进一步了解我国 PJ的种群特征和进化情况。　　研究结论：　　1.本研究结果表明 AIDS合并肺部感染的人群中运用PCR诊断为 PCP的阳性率高，提示在我国南方地区肺孢子菌肺炎仍然是 AIDS患者的常见的机会性感染之一。　　2.对于 PCP诊断的实验方法，PCR法比传统的 GMS染色法的敏感性高，对样本采集的要求低，优点多，可以推广用于 PCP的实验室诊断。可用于分子检测、流行病学调查，并可为筛选 AIDS患者中PCP高风险人群提供参考依据。所用PJ-mtLSU rRNA的引物对 PJ高度敏感。序列分析结果表示该基因比较保守，突变少同源性大，与国内外研究结果基本一致，可以推广用于我国肺孢子菌的检测和流行病学等研究。　　3.我国南方地区 AIDS感染人群中肺孢子菌的基因具有多态性，其中mt LSUrRNA基因型在85和248的2个位点共分为5型。我国广州地区该基因型的分布以基因型4型占首位，比例为34%；其次是基因型1型和基因型2型，比例均为23%。　　4. ITS基因是分析 PJ基因多态性的良好位点。获得53条序列，共14种组合序列，Eg是最常见基因型，其中“BTM4g、BTM1i”是新发现的组合型。　　5. CYB基因型发现3种不同于原型序列的新序列，分别被命名为 CYB10型、CYB11型、CYB12型，没有检测到与文献报道的药物靶位基因的突变。　　6.我国南方地区 AIDS合并肺部感染人群中肺孢子菌 DHPS和DHFR基因型耐药相关位点的突变率低，可能与广州地区人群对于常见的上呼吸道感染或者社区获得性肺炎磺胺类药物不是推荐用药有关，还有可能与病人初次感染有关，有待进一步研究.