研究背景：　　 胰腺癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，其恶性程度高，疾病进展快，早期转移率高，中位生存期短，5年生存率不超过5％，死亡率接近发病率，预后恶劣。由于胰腺癌发病的隐蔽性，缺乏早期的临床表现及症状的非特异性，因此确诊时往往己属晚期，丧失根治性手术的机会，即使是早期诊断并行了根治手术的病人，长期生存率仍低于15％，且存在术后容易复发的问题。大部分临床患者仅能行姑息手术结合术后辅助化疗或者直接放化疗，不幸的是，胰腺癌对放化疗并不敏感。胰腺癌预后差、容易复发的主要原因正是其早期转移率高，因此，防治胰腺癌转移是关键。　　 正常上皮细胞具有黏附依赖性，失去细胞间或细胞与基质接触将导致细胞程序性死亡，即失巢凋亡。失巢凋亡被认为普遍参与机体发生、发育、更新及退化的全过程，例如体内的各种空腔组织如肠管等的形成，此外还可防止脱落的细胞种植并生长于其他不适宜的地方，对于维护组织内环境稳定和结构完整具有重要意义。但当这种生理诱导机制发生异常则会导致疾病病理过程的发生，如目前认为失巢凋亡也参与心血管疾病及某些皮肤疾病的发生。而其在肿瘤侵袭转移过程中的关键作用是目前研究的热点之一。目前认为，肿瘤细胞尤其是恶性程度高的肿瘤细胞具备抵抗失巢凋亡的能力。肿瘤转移是个多阶段的过程，涉及基质降解、肿瘤细胞游走浸润、肿瘤细胞再黏附等过程，当肿瘤细胞由于某个基因缺失、突变或者某个凋亡信号通路的缺陷而具备了抵抗凋亡的能力，则在其脱离原发灶进入血液或淋巴循环系统，失去基质支持，发生侵袭转移时即不发生失巢凋亡，从而实现远处重定植形成转移灶的过程，这个结论在卵巢癌、口腔鳞癌、肠癌、肺癌等癌细胞体外培养实验都得到了证实。基于胰腺癌恶性程度高及早期转移、易复发的特点，我们推测其可能具备较强的抵抗失巢凋亡的能力。　　 自噬是细胞利用溶酶体降解自身大分子物质和受损的细胞器的生物学过程，它是细胞维持自稳、保证生存的重要方法之一，尤其是细胞在面临缺氧、营养供应不足、生长因子缺乏等不利条件时，其往往通过增加自噬活性来保证细胞的生存。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同可分为：大自噬、小自噬及分子伴侣介导的自噬。正常上皮细胞具有基础水平的自噬，且自噬与感染免疫、肿瘤耐药等也有关。研究表明，多个基因及信号途径参与自噬作用，包括PTEN基因、Beclin1基因、内质网应激、PI3K/AKT途径、RAS-RAF-1-MEK-ERK1/2途径等，其中PI3K/AKT是参与失巢凋亡的一个重要途径，因此推测，当细胞处于失巢的不良环境时，细胞可以通过作用彼此共同的途径PI3K/AKT途径来增强自噬水平缓解代谢压力、维持细胞生存抵抗失巢凋亡。　　 3-MA(3-甲基腺嘌呤)是常见的自噬抑制剂，其为Ⅲ型PI3K(hVps34)的抑制剂，能抑制胞浆型LC3Ⅰ向自噬体膜蛋白LC3Ⅱ的转化从而抑制自噬的激活。因此，本实验利用3-MA抑制自噬并通过研究胰腺癌细胞的凋亡率、增殖、迁移了解自噬在其中发挥的作用。　　 研究目的：　　 通过软琼脂培养法及poly-HEMA悬浮培养法模拟胰腺癌细胞失巢状态，并使用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤抑制细胞自噬水平，检测凋亡率、细胞增殖、迁移能力，观察自噬在胰腺癌细胞抵抗失巢凋亡中的作用及其对增殖、迁移的影响，从而开辟遏制胰腺癌抵抗失巢凋亡能力的新途径，为防治胰腺癌转移寻找新的靶点。　　 材料和方法：　　 实验材料：　　 胰腺癌细胞系PANC1、SW1990为中山二院消化内科保存，永生化胰腺导管上皮细胞H6C7为由加拿大安大略癌症研究所惠赠；自噬抑制剂3-MA购自Merck公司；poly-HEMA、羊抗兔-FITC IgG购自Sigma公司；LC3多克隆兔抗人抗体购自Abcam公司，低熔点琼脂糖购自Amersco公司。　　 实验方法和分组：　　 1、细胞培养　　 胰腺癌细胞株PANC1、SW1990：常规培养在含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基。　　 永生化胰腺导管上皮细胞H6C7：常规培养在KSFM培养基。　　 2、实验分组：1：悬浮处理组2：悬浮对照组3：贴壁处现组4：贴壁对照组。　　 3、软琼脂培养基培养法观察处理组及对照组的集落形成情况。　　 4、Poly-HEMA悬浮培养法诱导失巢凋亡。　　 5、Annexin V/PI染色流式细胞技术检测失巢凋亡率。　　 6、透射电镜观察自噬体及免疫荧光检测自噬特征性蛋白MAP1-LC3来评估自噬水平。　　 7、WST-CCK8了解悬浮培养下处理组及对照组细胞的增殖能力。　　 8、细胞迁移试验：Transwell小室了解悬浮培养下处理组及对照组细胞的迁移能力。　　 统计学方法：　　 数据以均数±标准差表示，两组均数间比较采用t检验，多组均数间比较采用单因素方差分析。应用SPSS13.0 for windows统计软件进行统计学处理，显著性差异水平为P＜0.05。　　 结果：　　 1.胰腺癌细胞具有抵抗失巢凋亡的能力：胰腺癌细胞PANC1在软琼脂培养2周后处理组(5 mmol/l3-MA)形成集落数为7.00±2.65个，对照组为13.50±6.60个；SW1990处理组形成集落数为2.25±2.63个，对照组为8.50±3.11个；H6C7两组均未见集落形成，P=0.007,组间有差异。　　 2.悬浮培养诱导胰腺癌细胞株凋亡，3-MA作用24h可增加失巢状态SW1990凋亡率：　　 1)SW1990悬浮培养处理组(悬浮培养条件下以5mmol/l的3-MA作用24h)凋亡率为：(16.60±2.36)％；悬浮培养对照组(单纯悬浮培养24h)为：(9.70±1.76)％；贴壁培养处理组(贴壁培养条件下以5mmol/l的3-MA作用24h)为(5.14±2.44)％；贴壁培养对照组(单纯贴壁培养24h)为(2.94±1.35)％；P=0.000，组间具有统计学差异。　　 2)PANC1悬浮培养处理组(悬浮培养条件下以5mmol/l的3-MA作用24h)凋亡率为：(14.14±2.69)％；悬浮培养对照组(单纯悬浮培养24h)为(19.80±8.11)％；贴壁培养处理组(贴壁培养条件下以5mmol/l的3-MA作用24h)为(14.10±2.57)％；贴壁培养对照组(单纯贴壁培养24h)为(9.20±0.49)％，除悬浮对照组与贴壁对照组P=0.028外余两组间比较无统计学差异。　　 3.5 mmol/l3-MA对SW1990凋亡率的影响呈时间依赖性：悬浮培养会诱导SW1990细胞凋亡，随时间延长呈上升趋势；悬浮处理组3-MA作用12h及24h皆较对照组失巢凋亡率增加。　　 4.3-MA作用24h对胰腺癌细胞株SW1990凋亡的影响呈剂量依赖性：随着3-MA浓度的提高，凋亡率呈现上升趋势。　　 5.5 mmol/l3-MA能够抑制胰腺癌细胞株增殖：　　 1)WST-CCK8法酶联免疫检测仪450nm、630nm双波长OD值SW1990悬浮培养24h处理组为1.257±0.141；对照组为1.959±0.284；P=0.007。SW1990悬浮培养48h处理组为1.572±0.173；对照组为2.077±0.205；P=0.031，组间有差异。　　 2)WST-CCK8法酶联免疫检测仪450nm、630nm双波长OD值PANC1悬浮培养24h处理组OD值为1.461±0.085；对照组为2.024±0.058；P=0.000。PANC1悬浮培养48h处理组为1.702±0.040；对照组为2.161±0.100；P=0.001，组间有差异。　　 6.5 mmol/l3-MA抑制胰腺癌细胞株的迁移能力：　　 1)Transwell小室检测胰腺癌细胞迁移能力：SW1990悬浮培养24h处理组每400×视野平均穿膜细胞数为：25.13±3.79；对照组为：81.3±3.86；贴壁对照组为：3.23±0.96；贴壁处理组为：1.27±0.45，P=0.000，组间有差异。　　 2)Transwell小室检测胰腺癌细胞迁移能力：PANC1悬浮培养24h处理组每400×视野平均穿膜细胞数为：26.87±3.45；对照组为：67.40±9.35；贴壁处理组为：26.17±2.14；对照组为：69.73±1.21，P=0.000，组间有差异。　　 7.胰腺癌细胞株存在自噬现象。　　 1)免疫荧光法标记MAP1-LC3蛋白，胰腺癌细胞系SW1990、PANC1贴壁对照组、悬浮培养处理组(5 mmol/l，10 mmol/l，20 mmol/l3-MA)及悬浮对照组均为阳性。　　 2)透射电镜：SW1990悬浮处理组(20 mmol/l3-MA)平均每个细胞可见自噬体3.00±1.00个；对照组可见自噬体7.40±4.86个，P=0.158，组间无差异。PANC1悬浮处理组(20 mmol/l3-MA)平均每个细胞可见自噬体3.33±2.52个；对照组平均每个细胞可见自噬体4.00±2.83个，P=0.749。　　 结论：　　 1.与永生化胰腺导管上皮细胞相比，胰腺癌细胞具有较强的抵抗失巢凋亡能力。　　 2.胰腺癌细胞株在正常贴壁培养、悬浮处理组、悬浮对照组均存在自噬活性。　　 3.3-MA可抑制胰腺癌细胞系SW1990、PANC1细胞增殖和迁移并能显著提高SW1990失巢凋亡率，其可能通过抑制与自噬有关的PI3K/AKT途径。