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研究目的：以xCT缺陷的Sut黑色素细胞为研究对象,以野生型Mela黑色素细胞为对照,应用差异蛋白质组学方法研究Sut细胞蛋白质表达谱的变化,从蛋白质组水平上寻找与xCT缺陷相关的蛋白质,为研究xCT缺陷引起的细胞生长抑制的机理提供实验支持。研究方法：1.Sut和Mela细胞的培养、收集与总蛋白质的制备Sut和Mela细胞用含10%胎牛血清,100units/ml双抗的DMEM/F12培养液,于37℃,5%C02细胞培养箱培养,收集对数生长期的细胞,细胞中加入适量裂解液裂解后以1,7000r/mmin高速离心,45min,取上清液即为细胞总蛋白。2.Sut和Mela细胞总蛋白质的二维凝胶电泳及差异蛋白质的串联质谱分析以Bradford方法测定Sut和Mela细胞的总蛋白浓度,对两组样品分别进行二维凝胶电泳,应用PDQuest软件分析两组样品的二维凝胶电泳图谱,挑选出Sut细胞中表达量明显变化的蛋白质点,对这些蛋白质点进行串联质谱分析。3.数据库查询鉴定差异蛋白质将串联质谱分析得到的数据输入Mascot软件,在SWISS-PROT数据库中搜索,鉴定出差异蛋白质。4. RT-PCR方法检测Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA水平提取Sut和Mela细胞的总RNA,反转录获得细胞cDNA,通过PCR扩增Calmoduln、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的基因,扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。凝胶扫描,保存图像,通过绘制柱状图对比Sut细胞与Mela细胞mRNA表达量差异水平研究结果：1.Sut细胞表达差异蛋白质的鉴定比较Sut和Mela细胞总蛋白质的二维凝胶电泳图谱,发现Sut细胞有20个蛋白质表达量发生明显变化,其中10个蛋白质表达量明显上调,另外10个明显下调。对这20个蛋白质点进行串联质潜分析,将质谱分析得到的数据在SWISS-PROT数据库中搜索查询,鉴定出这些蛋白质。表达量上调的10个蛋白质分别为：波形纤维蛋白(Vimentin),肌动蛋白alpha-1 b (Tubulin alpha-1 b),肌动蛋白beta-5 (Tubulin beta-5),钙依赖磷脂结合蛋白A3 (Annexin A3),钙调素(Calmodulin),钙结合蛋白S100-A4 (protein S100-A4),分子量为11kDa的未知蛋白质,钙结合蛋白S100-A6 (protein S100-A6),核苷二磷酸激酶B(Nucleoside diphosphate kinase B,NME2),甲酰谷胱甘肽(S-formylglutathione);表达量下调的10个蛋白质分别为：钙腔蛋白(Calumenin), N-Myc下游调控基因1 (N-Myc downstream regulated genel,NDRGl)蛋白,鸟氨酸氨基转移酶(Ornithine aminotransferase),二硫键异构酶A3(protein disulfide isomerase A3，PDIA3),二氢嘧啶酶相关蛋白2(Dihydropyrimidinase-related protein2，DPYSL2), ATP合成酶ATP5A1 (ATP5A1), H2B组蛋白(Histone H2B type 1-K, HISTLH2BK),分子量为14kDa的未知蛋白质,基因序列号为OTTMUSG00000007855的未知蛋白质和分子量为47kDa的未知蛋白质。2. RT-PCR方法检测Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的1nRNA水平通过RT-PCR方法验证Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA水平。实验结果显示,和Mela细胞相比,Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA表达水平在Sut细胞中明显上调。研究结论：1.与Mela细胞相比,Sut细胞中有20个蛋白质点的表达量存在明显变化,其中10个蛋白质表达量上调,10个蛋白质表达量下调。有3个上调蛋白质为细胞结构相关蛋白(Vimentin, Tubulin alpha-lb, Tubulin beta-5),3个上调蛋白质为钙结合蛋白(Calmodulin, protein S100A-4, protein S100A-6),2个上调蛋白质为蛋白酶(S-formylglutathione, Annexin A3);5个下调的蛋白质为蛋白酶(protein NDRG1, PDIA3, ATP5A1, Ornithine aminotransfcrase aminotransferase, NME2),2个下调蛋白质为信号转导相关蛋白质(DPYSL2, HISTLH2BK3)2.鉴定出的xCT缺陷相关蛋白质在细胞的自体吞噬、胞内囊泡运输、MAP激酶信号通路,DNA复制等过程中起到重要作用,推测自体吞噬、MAP激酶信号通路可能在xCT缺陷引起的细胞生长抑制中起关键作用。自体吞噬、MAP激酶信号通路在Sut细胞生长抑制中的作用还有待于进一步研究。3.通过RT-PCR实验发现,和Mela细胞相比,Sut细胞中Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4的mRNA表达水平明显上调,证明xCT缺陷的Sut细胞通过转录水平上调控Calmodulin、Annexin A3、Vimentin和S100-A4蛋白的表达水平。