甘蓝型油菜IDD基因家族成员鉴定及Bna.A08IDD7a基因功能分析

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我国是世界上最大的油菜(Brassica napus)生产国和菜籽油消费国,每年可提供优质食用油约520万t,占国产植物油的47%,同时还生产高蛋白饲用饼粕约800万t。但是,目前我国食用植物油供给形势仍较为严峻,自产量不足,严重威胁到了我国的食用植物油安全。油菜生产主要利用冬闲田,不与粮食作物争地,目前长江流域尚有冬闲田66 hm~2以上,具有巨大的发展油菜产业的潜力。IDD基因家族是广泛存在于植物中的一类Cys2His2锌指结构(C2H2)转录因子,涉及植物生长发育的多个调控途径,对作物产量具有较为重要的影响。目前,IDD基因家族成员在拟南芥(Arabidopsis thaliana)、水稻(Oryza sativa)和苹果(Malus)等物种中已做了较为全面的研究,但油菜中还鲜有报道。为此,本研究首先对甘蓝型油菜以及两个亲缘物种白菜(Brassica rapa)和甘蓝(Brassica oleracea)中IDD基因家族成员进行全基因组水平的鉴定,并对甘蓝型油菜的IDD家族成员理化特性、进化和表达模式等进行分析。根据前期比较和分析结果,在油菜中选择了BnIDD7的一个成员Bna.A08IDD7a(Bn A08g0304090.1)进行了基因功能探究。主要研究结果如下:1.甘蓝型油菜IDD基因家族的鉴定及生物信息学分析在甘蓝型油菜基因组中共鉴定了58个IDD基因,其中53个基因不均匀分布在16条染色体上,剩余5个基因在染色体上的位置尚不清楚。蛋白质理化性质分析表明,BnIDD成员氨基酸数量在378~589 aa之间,分子量在43.05~63.40 k Da之间,等电点(p I)均>7,在7.15~9.66之间,所有蛋白均为亲水蛋白且90%为不稳定蛋白质。BnIDD蛋白中,所有成员均不含信号肽,48%蛋白含有跨膜结构,亚细胞定位预测显示所有成员均位于细胞核中。基因结构分析表明,大多数的BnIDD基因含有3-4个外显子且在序列的3’端包含一个较长的外显子,大多数直系同源基因的内含子的插入位置和相位高度相似,此外,同源蛋白间具有相似的蛋白基序(motif)且所有成员均包含N末端DNA结合结构域-锌指结构域。系统发育分析表明,十字花科IDD家族基因可分为6个亚家类,Subfamily 5和Subfamily 6属于古老分支,Subfamily 4属于中间支,而Subfamily 1-3是现代支,进一步分析发现IDD基因在现代支较在古老分支和中间支进行了更为严重的扩张复制;同时,基因复制类型分析发现,白菜和甘蓝之间的异源加倍和染色体片段复制是油菜基因组中IDD基因扩增的主要驱动力。mi RNA预测分析显示,大多数BnIDD成员含有Bna-mi R6029靶位点。BnIDD基因启动子分析表明,该家族的基因启动子包含多个与植物激素、光信号和植物发育相关的顺式调控元件。BnIDD家族基因表达模式表明,BnIDD1,BnIDD7在各组织器官中均表达,其他基因在油菜不同发育阶段的组织器官中均具有较为宽泛的表达谱。2.Bna.A08IDD7a基因功能初步探究通过对Bna.A08IDD7a基因编码区(coding sequence,CDS)和启动子序列扩增,成功构建了该基因的过表达载体(p Early Gate101-Bna.A08IDD7a)、RNAi载体(p FGC5941M-RNAi-IDD7a)和启动子载体(p CAMBIA1305.1-Bna.A08IDD7a),并且通过将Bna.A08IDD7a蛋白在洋葱表皮中进行亚细胞定位,表明该蛋白属于细胞核表达蛋白。将启动子载体遗传转化野生型拟南芥Col-0获得T1代阳性拟南芥种子,对不同发育期的植株进行GUS组织化学染色后发现,GUS活性在拟南芥的各个组织中均有较强表达水平,这表明Bna.A08IDD7a基因具有驱动GUS报告基因在拟南芥各个组织中组成型表达的特性。过表达载体遗传转化野生型拟南芥Col-0和甘蓝型油菜ZS11,本研究成功获得了T1代阳性拟南芥种子和T0代阳性油菜植株15株。通过观察T1代阳性过表达拟南芥种子及野生型拟南芥种子在3 d内发芽情况发现,过表达阳性拟南芥种子的发芽情况与野生型相同,说明Bna.A08IDD7a基因可能与种子的萌发无关。通过观察T1代过表达拟南芥幼苗及野生型拟南芥幼苗表型发现,过表达阳性拟南芥幼苗的根长明显短于野生型,猜测Bna.A08IDD7a基因通过某种调控途径参与到植株的根的发育中。通过克隆Bna.A08IDD7a基因的CDS区构建了酵母双杂交诱饵载体p GBKT7-IDD7a,利用酵母的接合生殖使诱饵蛋白与c DNA文库杂交共筛选得到237个与Bna.A08IDD7a蛋白潜在的互作蛋白,互作蛋白的基因本体论(Gene Ontology,GO)注释分析显示与Bna.A08IDD7a蛋白互作的基因涉及核糖体生物发生、糖酵解、葡萄糖分解代谢、水转运、生长素介导的信号通路、种子萌发的负调控、调节种子发芽和对远红光的反应等生物过程。通过对基因注释和测序比对结果分析,本研究选择了12个潜在的互作蛋白进行点对点互作验证,发现有3个蛋白与Bna.A08IDD7a蛋白存在物理交互作用,分别为Bna.A02Kana(Bn A02g0053180.1),Bna.C02Kanb(Bn C02g0476580.1),Bna.A05SWC4a(Bn A05g0186340.1)。为了初步探究Bna.A08IDD7a基因的调控通路,本研究根据前期分析和转基因表型猜测,该基因可能涉及生长素(IAA)及赤霉素(GA)调控通路,为此本研究分析了IAA通径的重要基因PIN1和GH3.3、GA通径的重要基因RGL和GA4及3个互作基因在过表达转基因植株中的相对表达量。q RT-PCR定量结果表明,PIN1和GH3.3基因在转基因植株中的表达量显著上调,RGL基因在转基因植株中的表达量显著下调而GA4基因上调,3个互作基因在转基因植株中的表达量相对下调,表明Bna.A08IDD7a基因可能参与到IAA通径及GA通径中来调节植物的生长发育,但仍需进一步实验验证。
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