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第一部分 慢性睡眠剥夺影响成长期大鼠骨形成的研究研究背景与目的:既往一些临床横断面研究提示睡眠剥夺可能与骨骼健康存在相关性,当今社会睡眠问题在青少年中越来越普遍。青少年期正是生长发育的关键时期,睡眠剥夺对成长期骨骼发育以及对骨代谢的影响,尚缺乏相关研究探索。本研究的目的在于研究慢性睡眠剥夺（CSD,Chronic sleep deprivation）对成长期大鼠骨骼发育和骨代谢的影响,并初步探索其可能相关机制。研究方法:20只5周龄Wistar雄鼠,经过1周适应性饲养后随机分为CSD组和正常对照组（normal control,NC）组。CSD组进行每日8:00-18:00进行连续10小时睡眠剥夺,连续干预时间6周时间,对照组饲养于相同环境但不进行任何干预。在干预0、2、4、6周时分别采集两组大鼠眼内眦静脉血,动态观察大鼠血清骨转换生物标志物（bone turnover markers,BTMs）水平变化,包括成骨指标Ⅰ型胶原N端前肽（Procollagen type IN-terminal propeptide,P1NP）和破骨指标Ⅰ型胶原 C 端肽交联（Carboxyl-terminal telopeptide of type 1 collagen,β-CTX）。6 周后用过量麻醉药物处死大鼠,取双侧股骨标本,分别进行Micro-CT扫描、骨组织形态学观察、骨组织转录组学测序（RNA-seq）、骨组织蛋白印迹法（western blot）检测。采用SPSS 24.0软件进行数据统计分析。研究结果:（1）CSD大鼠骨代谢的表现:CSD影响生长期大鼠的骨骼生长发育,主要是抑制了骨形成过程。①Micro-CT数据显示,CSD组大鼠的骨微结构异常,骨小梁静态参数骨体积分数（Bone volume/tissue volume,BV/TV）和骨小梁数量（Trabecular number,Tb.N）显著降低（BV/TV:0.267±0.009 vs 0.223±0.016,p=0.031;Tb.N:3.514±0.124 vs 3.057±0.154,p=0.033）;骨小梁分离度（Trabecular separation,Th.Sp）和骨小梁结构模型指数（Structure Model Index,SMI）趋于增加,但未达到统计学差异（分别p=0.065,p=0.075）。②病理组织切片染色观察骨组织形态学分析提示,CSD组大鼠股骨干骺端生长板发育异常,软骨细胞增殖区细胞减少,软骨细胞肥大区增宽,软骨钙化区松质骨减少,骨小梁骨结构连续性差、排列紊乱、骨小梁空隙增大,成骨细胞减少,提示生长大鼠成骨减少,新骨形成和矿化受损。③血清标志物检测结果提示CSD干预6周后骨转换水平明显降低（P1NP:442.4±70.9pg/ml vs 142.4±28.6pg/ml,p=0.002;β-CTX:935.2±20.6pg/ml vs 706.1 ±43.5pg/ml,p＜0.001）;CSD可抑制血清骨形成标志物（P1NP）的水平,并在干预期间逐渐下降,最终与骨吸收标志物（β-CTX）失偶联,即使在调整了体重等混杂因素后,差异仍然显著。（2）CSD影响骨代谢可能的机制探索:CSD抑制了骨骼发育和成骨细胞分化相关的基因和蛋白表达。①免疫组化分析,CSD组股骨组织中的成骨相关蛋白Col1α1和OCN表达明显减少。②RT-qPCR的结果显示,与成骨相关的mRNA,如igf1、bglap、runx2、col1αl和pth1r的表达也呈不同倍数显著下调。③通过RNA-seq将DEGs进行富集分析,GO富集分析提示CSD组的成骨分化信号通路和骨骼发育信号通路明显下调,且GSEA的功能富集表明,这两种信号通路中的大部分基因在CSD大鼠中显著下调。CSD抑制了骨组织中的PI3K/AKT信号通路。①KEGG富集分析提示PI3L/AKT信号通路显著下调。②通过western blot评估的蛋白表达水平进一步验证PI3K、AKT及其磷酸化蛋白表达水平下降,可能部分解释了成骨分化和骨形成受损的原因。研究结论:（1）CSD影响生长期大鼠的骨骼生长发育,主要是抑制了骨形成过程,同时下调了成骨细胞分化相关的基因和蛋白表达,而且PI3K/AKT信号通路受抑制可能是介导这一过程的重要病理生理机制之一。（2）青春期是积累骨量的关键是时期,生长发育期的良好睡眠对于积累骨量、保护骨骼健康发育,以预防晚年的骨质疏松症至关重要。第二部分 急性睡眠剥夺的生长期大鼠骨转换指标变化及转录组学分析研究背景与目的:急性睡眠剥夺（sleep deprivation,SD）指数小时至数十小时内部分或全部睡眠缺失,常见于轮班工作者或存在特殊情况的人群。既往研究发现一夜的睡眠剥夺即可影响海马组织及心血管内皮组织基因转录,但急性睡眠剥夺对骨组织mRNA表达的影响尚无研究。SD对骨代谢影响目前知之甚少。因此,本研究探索急性睡眠剥夺对大鼠骨转换状态的影响和骨组织mRNA的表达变化。研究方法:以5周龄Wistar雄鼠为研究对象,进行适应性饲养1周后,随机分为SD组、SD后恢复睡眠组（SD+R组）、正常对照组（NC组）,分别进行睡眠剥夺干预72小时,正常睡眠不受干预,睡眠剥夺干预72小时后恢复正常睡眠48小时。采用改良多平台法建立急性睡眠剥夺模型,进行连续72小时睡眠剥夺干预,动态监测大鼠血清骨转换生物标志物（bone turnover markers,BTMs）水平变化,包括成骨指标I 型胶原 N 端前肽（Procollagen type I N-terminal propeptide,P1NP）和破骨指标 I型胶原 C 端肽交联（Carboxyl-terminal telopeptide of type 1 collagen,β-CTX）。72小时睡眠剥夺干预结束后立即取NC组和SD组大鼠股骨组织进行转录组学测序,对表达差异的基因进行筛选及KEGG功能注释分析和GO富集分析。研究结果:（1）与NC组大鼠相比,SD干预后大鼠的血清P1NP水平明显降低（p＜0.05）;血清β-CTX水平则明显升高（p＜0.05）。SD+R组大鼠自身BTMs前后对比,血清骨转换指标逐渐恢复正常,提示SD改变生长期大鼠的骨转换状态,使骨形成和骨吸收失偶联,骨形成状态更加活跃,而骨吸收收状态到抑制。（2）SD组大鼠与NC组大鼠相比,共4441个差异基因（padj值＜0.05）,其中1985个基因表达上调,2456个基因表达下调。72小时SD上调了部分骨骼吸收、形成和分化相关的基因,如Tnfrsf11a、Ctsk、spp1、pth1r,并且上调了多种信号通路,包括骨吸收、骨重建信号通路,KEGG富集分析提示氧化磷酸化通路、阿尔茨海默病通路上调;而甲状腺激素信号通路、甲状旁腺激素合成、分泌通路和胰岛素信号通路等显著下调。研究结论:（1）本研究发现72小时急性睡眠剥夺即可迅速影响处于生长期个体的骨形成大于骨吸收的正常生理活动,继而呈现骨吸收更加活跃,且大鼠骨重建相关的mRNA表达增加。（2）睡眠对维持骨转换的正常生理状态至关重要,是影响骨骼状态的重要因素,即使急性睡眠剥夺对骨骼的也会造成一定影响。