肿瘤淋巴细胞浸润(Tumor infiltrating lymphocytes，TIL)是预测免疫治疗疗效、判断预后的重要病理指征。研究表明，炎性组织内CD8+T淋巴细胞浸润与粘附分子和趋化因子作用有关。多条胞内途径调节趋化因子表达，包括STAT3信号途径、Notch途径、β-catenin途径和PI3K途径等。粘附分子、趋化因子和细胞因子等炎性介质，及其相应的分子信号途径共同组成肿瘤微环境中复杂的免疫调控网络。其中，关键趋化因子异常，可能抑制免疫活性细胞进入肿瘤组织，从而成为影响免疫治疗效果或产生免疫抵抗(immunoresistance)的重要因素。因此，深入探讨淋巴细胞肿瘤浸润的分子机制，对于发现新的治疗策略及提高免疫治疗效果具有重要意义。　　MicroRNAs(miRNAs)是一类长度约18-24个核苷酸的内源性非编码RNA，通过与靶基因mRNA3端UTR区同源结合，抑制mRNA翻译或导致mRNA降解。miRNAs调节多种重要的细胞功能，如细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤发生。miRNAs同时参与肿瘤炎症反应，对免疫细胞移动、免疫原性(immunogenicity)等具有重要调控作用。miRNA-21是一种原癌miRNA，在大多数肿瘤中均有表达。miRNA-21通过抑制多种靶基因，调控细胞增殖、移动和侵袭、凋亡及药物抵抗。生物信息学研究表明STAT3可能是miRNA-21的靶基因。另有研究证实，在骨髓瘤细胞中PIAS3，即活化STAT3抑制物(protein inhibitor of activatedSTAT3，PIAS3)，是miRNA-21的靶基因。既往研究表明，STAT3在多种类型恶性肿瘤中组成性活化，能够调控多种肿瘤炎症相关重要靶基因表达，如IL-6、IL-10、COX2。阻断肿瘤细胞内STAT3表达，可调控趋化物质表达，诱发包括淋巴细胞在内的多种类型免疫细胞移动。　　基于上述研究，我们提出如下假说:miRNA-21可能调节肿瘤细胞分泌趋化因子并诱导淋巴细胞移动;其作用靶点可能是STAT3密切相关基因，如STAT3或PIAS3;上述miRNA-21-STAT3-趋化因子信号途径可能是调节肿瘤淋巴细胞浸润的重要分子机制。　　本研究以乳腺癌为研究对象。主要从以下方面进行:　　研究目的：　　1.筛选与乳腺癌淋巴细胞浸润有关的miRNAs，即在肿瘤组织中有淋巴细胞浸润的乳腺癌患者的外周血中哪些miRNAs的表达被上调或下调。　　2.研究被上调或下调的miRNA对乳腺癌细胞系MCF-7的调控作用，即是否与预期相符调节了趋化因子的分泌。　　3.探讨上调或下调的miRNA发挥上述调节作用的机制。　　研究方法：　　1.肿瘤组织内有或无淋巴细胞浸润的乳腺癌患者，血清中miRNAs表达的差异1.1组织切片HE染色，显微镜下观察肿瘤组织中淋巴细胞浸润情况。　　1.2荧光定量RT-PCR方法检测对应外周血血清中miRNA-155和miRNA-21的表达水平。　　1.3统计分析血清中miRNAs表达与肿瘤组织内淋巴细胞浸润的相互关系。　　2.表达变化的miRNA对MCF-7细胞分泌趋化因子及淋巴细胞移动的影响2.1将合成的miRNA-21模拟物和miRNA-21抑制物分别转染MCF-7细胞，72h后ELISA检测细胞培养上清中趋化因子RANTES和IP-10的表达。　　2.2以上述miRNA-21抑制物转染MCF-7细胞，取细胞培养上清作为条件培养基，Transwell体外趋化实验分析在MCF-7细胞内下调miRNA-21对小鼠脾脏分离淋巴细胞的趋化作用。　　3.表达变化的miRNA调节MCF-7细胞分泌趋化因子的作用机制研究3.1 Western blot和荧光定量RT-PCR检测预测靶基因的表达水平，验证确定靶基因（根据文献中已有的双荧光素酶基因报告系统结果）。　　3.2 siRNA下调靶基因及下游分子表达，观察对miRNA-21发挥上述调节作用的影响，从而证明miRNA-21的确通过调控该蛋白表达，参与调节趋化因子分泌和淋巴细胞移动。　　研究结果：　　1.乳腺癌组织中淋巴细胞浸润与血清中miRNA-21表达水平负相关根据文献，我们筛选了2种最有可能与淋巴细胞浸润肿瘤组织有关的miRNAs，首先在收集的临床标本中验证，是否与淋巴细胞浸涧有关，分别是miRNA-21和miRNA-155。miRNA-21和miRNA-155均是分泌miRNAs，可存在于外周血中。我们合成了针对上述miRNAs的特异性茎环引物，用荧光定量RT-PCR方法检测并分析了明显淋巴细胞浸润组和无淋巴细胞浸润组对应外周血中上述miRNAs表达水平的差异。结果显示，明显淋巴细胞浸润组对应外周血中miRNA-21的表达水平明显低于无淋巴细胞浸润组，而miRNA-155的表达水平在明显淋巴细胞浸润组和无淋巴细胞浸润组间没有明显差异。相关性分析显示乳腺癌组织淋巴细胞浸润与血清中miRNA-21表达水平为负相关。　　2.miRNA-21下调导致MCF-7细胞分泌趋化因子RANTES和IP-10增加将miRNA-21模拟物和miRNA-21抑制物分别转染MCF-7细胞，荧光定量RT-PCR方法检测了MCF-7细胞内miRNA-21的表达水平。结果显示，在miRNA-21模拟物转染组，miRNA-21表达水平被上调20多倍。在miRNA-21抑制物转染组，miRNA-21表达水平被下调约80％。ELISA检测转染72h后细胞培养上清中趋化因子RANTES和IP-10的表达水平，结果显示，miRNA-21抑制物组与对照组相比，转染后细胞培养上清中趋化因子RANTES和IP-10表达明显增加。miRNA-21模拟物组与对照组相比，转染后细胞培养上清中上述趋化因子表达没有明显改变。考虑可能与MCF-7细胞本身高表达miRNA-21有关。因此接下来我们主要通过miRNA-21抑制物研究miRNA-21的调控作用。　　3.在MCF-7细胞内下调miRNA-21对淋巴细胞移动的影响如前所述，将miRNA-21抑制物转染MCF-7细胞，取转染72h后细胞培养上清作为条件培养基，用于体外Transwell淋巴细胞趋化实验。结果显示，与对照组相比，miRNA-21抑制物组的细胞培养上清，能趋化更多淋巴细胞移动。miRNA-21作为一种原癌miRNA，几乎所有研究集中于对细胞增殖、凋亡等细胞行为的影响。本研究首次从肿瘤细胞和免疫细胞相互作用的角度，报道了miRNA-21在调控肿瘤细胞趋化因子分泌和诱导淋巴细胞移动方面的作用。　　4.miRNA-21靶向调节MCF-7细胞内PIAS3蛋白表达已有研究利用双荧光素酶基因报告系统证实了PIAS3是miRNA-21的靶基因。另有生物信息学研究表明STAT3可能是miRNA-21的靶分子。已有研究证实STAT3在调节肿瘤组织淋巴细胞浸润过程中发挥重要作用。因此，我们推测miRNA-21调节趋化因子分泌作用与STAT3信号途径有关。我们检测了miRNA-21抑制物转染后，MCF-7细胞内PIAS3蛋白、STAT3蛋白以及磷酸化STAT3蛋白的表达水平。结果显示，与对照组相比，miRNA-21抑制物组细胞内PIAS3蛋白表达明显增加，STAT3蛋白表达没有明显改变，而磷酸化STAT3表达水平明显降低，说明miRNA-21的直接靶分子是PIAS3而不是STAT3。荧光定量RT-PCR检测PIAS3 mRNA表达水平，结果显示，与对照组相比，miRNA-21抑制物组PIAS3 mRNA表达水平没有明显改变，说明miRNA21在转录后水平抑制PIAS3蛋白表达。　　5.miRNA-21调控MCF-7细胞趋化因子分泌和诱导淋巴细胞移动是通过靶向调节PIAS3和STAT3信号途径一个miRNA分子可作用于数个mRNA靶分子。虽然我们证实了在MCF-7细胞中，miRNA-21可靶向调节PIAS3蛋白表达和STAT3磷酸化。但并不能说明miRNA-21调控MCF-7细胞趋化因子分泌和淋巴细胞移动是通过靶向PIAS3实现的。因此，我们采用siRNA抑制MCF-7细胞内PIAS3蛋白表达，以观察其对miRNA-21调控MCF-7细胞趋化因子分泌的影响。我们合成了PIAS3 siRNA，转染MCF-7细胞后，发现可明显抑制PIAS3蛋白表达，胞内STAT3蛋白磷酸化水平升高，但总STAT3蛋白表达没有明显改变，以上结果与文献相符。进一步研究发现，相对于PIAS3 siRNA阴性对照组，PIAS3 siRNA组细胞培养上清中RANTES和IP-10表达量明显降低，趋化的淋巴细胞数量明显减少。相对于miRNA-21抑制物组，miRNA-21抑制物和PIAS3 siRNA共转染组上述趋化因子分泌表达量明显减少，趋化的淋巴细胞数量也明显减少。以上结果表明，在MCF-7细胞中抑制PIAS3蛋白表达，不仅可以减少RANTES和IP-10分泌以及淋巴细胞移动，并且能够逆转miRNA21抑制物促进上述趋化因子分泌和淋巴细胞移动的作用，说明PIAS3不仅调控MCF-7细胞分泌趋化因子RANTES和IP-10，诱发淋巴细胞移动，并且直接参与了miRNA-21对MCF-7细胞趋化因子分泌和淋巴细胞移动的调控作用。综上所述，本研究首次报道了miRNA-21通过靶向PIAS3负性调节MCF-7细胞趋化因子释放以及淋巴细胞移动。　　另外，研究中我们发现，相对于STAT3 siRNA或miRNA-21抑制物转染组，在同时转染了STAT3 siRNA和miRNA-21抑制物的MCF-7细胞培养上清中，趋化因子RANTES和IP-10的分泌表达量明显增加。说明STAT3和miRNA-21在调控MCF-7细胞趋化因子分泌表达过程中存在正反馈调节作用。　　结论：　　1、在肿瘤组织中有明显淋巴细胞浸润的乳腺癌患者，血清中miRNA-21的表达水平显著降低，肿瘤组织淋巴细胞浸润与血清中miRNA-21表达负相关。　　2、miRNA-21下调能够促进乳腺癌细胞系MCF-7细胞分泌趋化因子RANTES和IP-10，并诱发淋巴细胞移动。　　3、在MCF-7细胞中，PIAS3是miRNA-21的靶分子，STAT3不是miRNA21的靶分子。　　4、miRNA-21通过靶向调节PIAS3和STAT3信号途径，导致或部分导致了miRNA-21抑制趋化因子分泌和淋巴细胞移动的作用。　　创新点及意义：　　1、本研究首次证实了miRNA-21可调节肿瘤细胞趋化因子分泌和淋巴细胞移动。并且阐明了这种调节作用是通过靶向PIAS3和STAT3信号途径实现的。　　2、本研究为肿瘤微环境中免疫抵抗作用机制研究提供了新的实验依据，为肿瘤免疫治疗提供新的思路。