微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)是一种人兽共患的寄生性原虫,其宿主范围广,人畜感染率高,是引起腹泻的重要病原体之一。对免疫功能正常的宿主,腹泻一般为自限性的;对免疫缺陷的宿主(如AIDS患者),腹泻多为慢性的持续水泻,严重时可危及生命。迄今对微小隐孢子虫致病机理和入侵机制的了解较少,对隐孢子虫病尚无有效的预防和治疗措施。顶复门原虫对宿主细胞的粘附和入侵是其致病的关键,虫体入侵细胞时由顶端细胞器分泌一系列的蛋白,这些蛋白发生相互作用导致了虫体的入侵。微线蛋白是由微线体分泌的一种粘附相关蛋白,在虫体入侵宿主细胞的过程中发挥了重要作用。Rhomboid蛋白酶是一类膜内丝氨酸蛋白酶,存在于多种顶复门原虫体内,已有研究表明,弓形虫入侵宿主细胞的一个重要过程是Rhomboid蛋白酶水解其底物微线蛋白。而在C.parvum中,对微线蛋白起加工作用的Rhomboid蛋白还未见报道。另外,C.parvum感染宿主时,微线蛋白与宿主蛋白发生相互作用粘附宿主细胞是建立感染的重要步骤,因此鉴定与微线蛋白发生互作的宿主细胞蛋白对C.parvum入侵宿主细胞的分子机制研究有重要意义。目前在微小隐孢子虫中已报道的微线蛋白有GP900,TRAP-C1(TRAP)和MIC1,经序列分析,GP900和TRAP含有可与Rhomboid蛋白发生互作的位点,故本研究首先对C.parvum微线蛋白在粘附入侵方面的作用及免疫特性进行初步研究,并利用酵母双杂交、免疫共沉淀技术以及免疫沉淀-质谱法筛选并鉴定与其互作的Rhomboid蛋白和宿主蛋白,为揭示C.parvum入侵宿主细胞的分子机制提供理论依据。微小隐孢子虫微线蛋白TRAP的粘附侵入功能及免疫特性研究:RT-PCR扩增微线蛋白TRAP基因片段后构建重组表达质粒p ET28a-TRAP,表达并纯化重组蛋白TRAP,用Western blot方法检测r TRAP对宿主细胞的粘附作用。用纯化的r TRAP免疫小鼠制备抗血清,观察其体外入侵抑制效果,并对免疫血清进行体液免疫及细胞免疫水平的检测。结果显示,重组蛋白TRAP可特异性粘附宿主细胞,抗r TRAP血清对子孢子入侵宿主细胞有明显的抑制作用。免疫小鼠血清中Ig G抗体水平升高,细胞因子IL-2、IL-12和IFN-γ表达水平明显升高,说明r TRAP可诱导机体产生体液免疫应答和Th1型细胞免疫应答。与微小隐孢子虫微线蛋白相互作用的Rhomboid蛋白的筛选:利用酵母双杂交系统将C.parvum Rhomboid 1/4,T.gondii Rhomboid 2分别与诱饵载体p GBKT7连接构建重组诱饵质粒,经β-半乳糖苷酶活性检测诱饵蛋白无自激活作用。将C.parvum微线蛋白TRAP和GP900与捕获载体p GADT7连接构建重组捕获质粒,分别与重组诱饵质粒共转化酵母感受态细胞AH109,根据共转化组在选择培养基上的生长情况和β-半乳糖苷酶活性检测筛选与微线蛋白有相互作用的Rhomboid蛋白。随后构建Rhomboid和微线蛋白的重组真核质粒,转染细胞,利用免疫共沉淀方法进一步验证两者间的相互作用。结果表明C.parvum Rhomboid 1具有体外切割GP900蛋白的活性,T.gondii Rhomboid 2可以体外切割TRAP蛋白。丝氨酸蛋白酶抑制剂DCI对子孢子入侵宿主细胞的体外抑制试验显示,浓度为25μM的DCI可以有效抑制Rhomboid蛋白酶的活性来抑制子孢子对宿主细胞的入侵。与微小隐孢子虫微线蛋白GP900相互作用的宿主细胞蛋白的筛选:构建重组原核表达质粒p GEX-4T-GP900,表达并纯化重组蛋白GP900,与宿主细胞裂解液孵育结合,利用免疫沉淀-质谱法筛选与GP900互作的宿主蛋白,经二级质谱分析初步筛选出4种宿主细胞受体蛋白。再利用酵母双杂交技术对GP900与所筛选的宿主蛋白之间的互作进行进一步验证。结果鉴定出4种与微线蛋白GP900有相互作用的宿主蛋白,即膜联蛋白A2(ANXA2),β-肌动蛋白(ACTB),热休克蛋白5(HSPA5)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)。本试验对ANXA2进行原核表达并纯化,用重组蛋白ANXA2免疫小鼠制备抗血清,进行体外抗体阻断试验,结果表明抗r ANXA2血清对子孢子入侵宿主细胞产生一定抑制作用。综上所述,本试验对微线蛋白TRAP的粘附功能及免疫特性进行了研究,利用酵母双杂交和免疫共沉淀方法验证得出C.parvum Rhomboid 1具有体外切割微线蛋白GP900的活性。利用免疫沉淀-质谱法筛选出4种与微线蛋白GP900互作的宿主蛋白(ANXA2,ACTB,HSPA5,GAPDH),并用酵母双杂交方法进行了验证。本研究为揭示微小隐孢子虫入侵宿主细胞的分子机制提供了理论依据,并为寻找新的防治隐孢子虫病药物和候选疫苗靶位奠定了基础。