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目的运用网络药理学的数据库和平台,筛选山茱萸、牡丹皮抗肝损伤潜在活性成分及靶点,并分析其可能作用途径;利用生物信息学技术筛选非酒精性脂肪肝炎的潜在生物标志物并筛选可能的小分子药物。方法1.山茱萸-牡丹皮抗肝损伤作用的网络药理学研究(1)运用TCMSP数据库搜索并筛选山茱萸、牡丹皮活性成分。在PubChem中收集每个化合物的SMILE结构式和SDF结构文件,利用SwissTargetPrediction、Drugbank、SEA数据库分别预测成分靶点。(2)在疾病数据库(TTD、GAD和DisGeNET)中搜索“Liver disease”“Liver injury”“Liver”“Hepatic”等关键词,收集肝损伤靶点,合并后去掉重复部分。(3)将成分靶点集和疾病靶点集取交集,即得到各成分对应的疾病靶点。通过DAVID平台进行GO和KEGG富集分析。以上操作全部选用人类数据库。(4)将成分、靶点、途径等数据导入Cytoscape软件构建网络,根据自由度排序筛选出网络中的核心成分及靶点。(5)另外,通过String数据库构建靶点之间的关系并挑选出PPI网络中的Top9中心靶点,应用GEO数据库和ROC曲线评价中心靶点与非酒精性脂肪肝炎过程中肝脏损伤的关联程度。2.基于生物信息学的非酒精性脂肪肝炎靶标筛选及小分子药物预测(1)在GEO数据库中搜索非酒精性脂肪肝炎的数据集,要求是临床样本并且含有健康对照组。(2)通过R语言软件中的“GEOquery”包下载原始数据集,并用0代替缺失值,采用PCA分析样本分组质量,用GE02R插件筛选数据集的差异基因,标准是|log2(FC)|>1和adj.p<0.05,可视化用过R包“ggplot2”实现。(3)通过RRA算法将各个数据集的差异基因整合,标准是由Bonferroni校正后的p<0.05和|log2(FC)|>1。(4)整合后的差异基因通过DAVID平台进行GO和KEGG富集分析,可视化通过R包“GOplot”实现。(5)通过String数据库构建基因之间的关系并导入Cytoscape软件构建网络,通过cytohubba插件及MCC算法挑选出网络中的Top10核心靶点,并借助ClusterONE插件进行聚类分析。(6)在CTD数据库里验证核心靶点以及富集分析的各途径。(7)最后,通过cMAP数据库和affymetrix平台实现差异基因的相关小分子药物匹配。结果1.筛选得到山茱萸、牡丹皮活性成分分别为20和11个,成分靶点分别有776和625个,疾病靶点有667个,取交集后得到两中药抗肝损伤靶点分别有52和69个,合并去重后共有78个。GO和KEGG富集分析中,GO-BP结果包含类固醇代谢、外源性物质代谢、类固醇激素介导的信号通路等,GO-CC包含细胞膜、细胞外空间、膜孔等,GO-MF包括RNA聚合酶Ⅱ转录因子活性、类固醇激素受体活性、酶结合等。KEGG结果有低氧诱导因子通路、肿瘤坏死因子通路、破骨细胞分化、胆汁分泌、胰岛素抵抗等途径。网络中核心成分有槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、谷甾醇、豆甾醇等,核心靶点有AKT1、PIK3CG、PTPN1、MAPK8、PPARA、ABCB1、TNF、JUN、EGFR、CYP2C19 等。ROC曲线评价结果显示,VEGFA、ESR1、MAPK8的曲线下面积处于>0.70～0.90之间,并且表达具有显著差异(P<0.05)。2.GSE17470、GSE24807、GSE37031和GSE89632纳入研究,主成分分析结果表明,各数据集在NASH组和对照组之间具有较好的区分度。RRA算法最终鉴定出59个差异基因,其中上调基因39个,下调基因20个。GO分析结果显示,GO-BP有细胞对激素刺激的反应、女性妊娠、炎症反应等,GO-CC有胞外间隙、胞外区、内质网等,GO-MF有转录因子活性、受体结合、胰岛素样生长因子Ⅱ结合等。筛选得到Top10核心靶点为FOS、ATF3、KLF4、CDKN1A、GDF15、KLF6、FOSB、GADD45B、CRP 和 ZFP36。筛选得到可能的小分子药物有阿霉素、坦螺旋霉素、氟维司琼、谷甾醇等。结论1.中药山茱萸和牡丹皮通过多成分、多靶点作用抗肝损伤,潜在活性成分以黄酮类和甾醇类为主,可能成为保肝药物的候选成分;潜在靶点可能是山茱萸、牡丹皮抗肝损伤的作用靶点,仍需进行实验研究验证。2.在综合生物信息学分析的基础上,筛选出与NASH相关的10个核心基因。对这些基因的研究将有助于我们进一步了解NAFLD和NASH的进展和机制。筛选出的小分子药物有可能成为治疗疾病的候选药物。此外,这些核心基因可能作为NAFLD或NASH的潜在生物标志物和治疗靶点,但仍需要进一步的临床前和临床实验。