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青枯病是一种主要的植物病害,对农业生产造成了巨大的危害。青枯病的病原菌为茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum),可腐生也可寄生,可在土壤中存活很长时间,是一种土壤习居菌。其传播途径多样,条件适宜时即迅速增殖,造成青枯病的爆发。由于轮作、套种等耕种措施应用的受限,化学防治对环境的污染且效果微弱,生物防治因此日益受到人们的重视。青枯病的生物防治主要有利用无致病力青枯菌以及青枯菌的拮抗菌。使用抗性品种也是较好的防治策略,但抗性品种的培育耗时长,也需要消耗大量的人力物力,而利用植物疫苗工程菌的刺激,诱导植物自身产生系统抗性,成为十分有潜力的防治方法。青枯菌致病性调控网络复杂,其中PhcA (phenotype conversion A)是该调控网络的核心因子。PhcA可被青枯菌的胞外信号分子3-羟基棕榈酸甲酯(3-hydroxypalmitic acid methyl ester,3-OH PAME)激活,正向调控胞外多糖EPS I (exopolysaccharides I)、胞外酶Pme (pectin methylesterase,果胶甲酯酶)的产生以及AHL (acyl-homoserine lactone)介导的群体感应系统。另外,PhcA负向调控嗜铁素的产生、细胞运动及对环境的耐受性。编码基因phcA位于青枯菌的染色体上,当青枯菌在植物维管束中迅速增殖时,PhcA的活性很高并开启青枯菌相关基因的表达,从而促进青枯菌的大量增殖。hrp (hypersensitive reaction and pathogenicity)基因簇也是一个重要的与致病相关的基因簇,存在于青枯菌的大质粒上。青枯菌的hp基因簇包含多达23个基因,主要编码青枯菌的关键致病因子——Ⅲ型分泌系统。在hrp基因簇两侧还分布有与hrp基因有关的调控基因(如植物信号调控相关基因prh)及分泌的效应蛋白编码基因(如popA)。本论文通过基因工程的方法,敲除Ralstonia solanacearum ZJ3721的phcA和hrp基因,构建了番茄无致病力青枯菌菌株,研究其诱导植物产生系统抗性以及防治番茄青枯病的能力,及作为植物疫苗工程菌广泛应用的可能性。研究结果如下：(1)解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)S20对茄青枯病的防控以实验室保存菌株B. amyloliquefaciens S20为生防菌,通过盆栽试验证明其对茄青枯病有较好的防控效果,与有机肥联合施用时防效可达70.7%。试验结果表明有机肥可提高S20在土壤中的存活能力,增加其在植株根际土中的定殖。高效液相色谱及液质联用分析表明,S20产生的主要抑菌物质为Iturin家族的物质有C13Iturin A、C14 Iturin A、C15 Iturin A和C16 Iturin A。(2) phcA-突变株和hrp-突变株的构建本研究以R. solanacearum ZJ3721为材料,通过同源片段的融合、重组,以sacB作为反向筛选标记基因,经过两轮重组和筛选,最终获得了R. solanacearum ZJ3721 phcA-突变株和hrp-突变株。其中phcA-突变株是在R. solanacearum ZJ3721菌株phcA基因阅读框内缺失了约700bp的DNA片段,hrp-突变株是在R. solanacearumZJ3721菌株Hrp基因簇内缺失了约2500bp的DNA片段。盆栽试验表明两个突变株都丧失了对番茄的致病能力。(3) phcA-突变株和hrp-突变株的特性phcA-突变株和hrp-突变株在生长和碳源代谢上也与野生菌株表现出很大的不同。在营养丰富的条件下,突变株在对数生长期的中后期生长速度明显慢于野生菌株,并在稳定期时菌体浓度显著小于野生菌株。phcA-突变株表现出了对糊精、D-果糖和D-葡萄糖酸较快的利用能力；phcA-突变株和hrp-突变株都表现出了对α-D-葡萄糖、D-甘露醇和蔗糖等23种碳源较快的利用能力；但突变株丧失了利用γ-氨基丁酸的能力。phcA-突变株和hrp-突变株的多种致病基因的表达都受到了抑制。葡聚糖内切酶基因(egl)、与致病相关的转录调控基因(xpsR)、胞外蛋白基因(tek)和分泌胞外多糖的内膜蛋白基因(epsE)的表达都受到了95%以上的抑制。(3) phcA-突变株对番茄青枯病的防治效果盆栽试验检测了phcA-突变株作为生防菌株对番茄青枯病的防治效果。结果显示,同时接种病原菌和phcA-突变株,防效微弱,只能延缓发病一天左右；但提前3天接种生防菌表现出显著防效,25天后防效可达90%。对番茄根际土中病原菌和生防菌数量的测定显示,提前3天接种生防菌比同时接种更能有效抑制番茄根际病原菌数量,接种8天后病原菌数量与对照相比下降了1.4个数量级。提前3天接种生防菌也更能有效抑制番茄植株茎中病原菌数量,并增加自身在茎内的定殖数量。(4) phcA-突变株诱导番茄的系统抗性通过水培试验考察了phcA"突变株对番茄系统抗性的诱导作用,结果表明,接种3天后,phcA-突变株对番茄水杨酸途径(salicylic acid, SA)、茉莉酸途径(jasmonic acid, JA)和乙烯信号途径(ethylene, ET)的基因都有不同程度的诱导。而且对于SA途径的PR-la和gluA基因,phcA-突变株的诱导表达量甚至比野生菌株的诱导表达量还高,分别是野生菌株诱导表达量的66倍和7.5倍。但该诱导效果在15天后显著下降。水培试验条件下R. solanacearum ZJ3721野生菌株和phcA-突变株在番茄根表的定殖数量显示,野生菌株的数量在15天内比较稳定,而phcA-突变株的数量在10天内较稳定,到15天时显著下降。(5) phcA-突变株和hrp"突变株也能诱导烟草植株的系统抗性研究结果表明,番茄青枯菌phcA-突变株和hrp突变株也能有效诱导烟草中茉莉酸(JA)信号途径和水杨酸(SA)信号途径的抗性基因的表达。而且,青枯菌突变株对烟草系统抗性的诱导效果显著强于试验的生防菌株Bacillus amyloliquefaciensSQR-7和Pseudomonas brassicacearum J12.生防菌株Bacillus amyloliquefaciens SQR-7不能诱导烟草植株的系统抗性,而Pseudomonas brassicacearum J12的诱导能力很弱。(6) phcA-突变株在土壤中的定殖研究表明,相比于单独接种phcA-,接种的同时使用猪粪堆肥和发酵菜粕组成的有机肥对phcA-突变株在土壤中的生长有一定的促进作用,但加入一定比例的干猪粪,其促进作用更大。(7) 3-OH PAME降解菌的分离本研究分离到一株3-OH PAME降解菌PE3菌株,其与青枯菌R. solanacearumZJ3721共培养条件下,致病相关基因xpsR、epsE、egl和tek的表达受到了明显的抑制。