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幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是一种微需氧革兰氏阴性杆菌,人群感染率超过50%。Hp感染与胃炎、胃癌等疾病发生密切相关。由于应用抗生素治疗Hp感染致耐药性增加、副作用大且不能预防重复感染,故Hp疫苗的研制和应用有望成为控制Hp感染流行最有效的途径。目前虽有疫苗进入临床试验,但据报道,该疫苗在免疫效果和研究设计等方面存在不足,且近年国内外出现大量关于Hp疫苗构建的基础性研究也提示Hp疫苗研究尚不成熟。Hp主要定植于人体胃黏膜,经口免疫是Hp疫苗免疫接种的合理途径。作为口服疫苗载体,乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)比常用的减毒沙门氏菌更安全,且研究证明用L.Lactis递送Hp尿素酶等疫苗抗原对小鼠可产生免疫保护作用,提示L.lactis具有作为Hp口服疫苗载体的发展潜力。Hp Lpp20是一种高度保守的外膜脂蛋白,也是Hp抗原免疫血清识别的主要菌体抗原,且具有良好的免疫原性,用含Lpp20的Hp外膜囊泡与霍乱毒素CTB联合免疫小鼠和豚鼠,可产生明显免疫保护效果,提示Lpp20是较理想的疫苗候选抗原。而目前以L.lactis递送Lpp20抗原对动物的免疫效果尚未鉴定。大肠杆菌不耐热肠毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin,LT)是生物源性黏膜免疫佐剂,LT B亚单位(LTB)因其基本无毒而比A亚单位更常用。制备天然LTB的效率低,而用大肠杆菌基因工程菌株制备重组LTB,需要蛋白纯化,且难以消除内毒素影响。若采用L.lactis表达LTB,则可以不经蛋白纯化,将菌体直接用于黏膜免疫,故建立LTB的乳酸菌表达系统对黏膜免疫佐剂的发展具有重要意义。因此,本研究利用前期建立的食品级L.lactis表达系统,分别构建Hp Lpp20和E.coli LTB的乳酸菌表达系统,并应用L.lactis重组菌株经口免疫小鼠,评价其对小鼠系统和局部免疫的影响及抗Hp攻击免疫保护效果,为抗Hp口服疫苗研究奠定基础。方法1.用PCR方法扩增Hp lpp20和E.coli lt B基因,分别将两种基因片段与克隆载体连接,用于转化E.coli DH5α菌株。从重组菌株中提取质粒,经双酶切回收基因片段,应用表达载体p NZ8149-SP和电穿孔法,将基因片段转入L.lactis NZ3900菌株,并用Elliker培养基筛选重组菌株。2.用乳链菌素(Nisin)诱导L.lactis重组菌株的表达,分别制备菌体蛋白和培养基上清蛋白样品,应用Western blot法,以小鼠抗Hp血清和抗LTB抗体为一抗,鉴定重组菌株对Lpp20和LTB的表达及其免疫反应性。3.将BALB/c小鼠随机分成4组(Lpp20组、Lpp20+LTB组、NZ3900组和PBS组),分别用NZ3900/p NZ8149-SP-lpp20菌液、NZ3900/p NZ8149-SP-lpp20与NZ3900/p NZ8149-SP-lt B混合菌液、NZ3900/p NZ8149-SP菌液和PBS对小鼠进行灌胃免疫,收集小鼠的血清和粪便样品,用ELISA法检测特异性血清Ig G和肠道SIg A抗体;用Hp 11637菌株攻击感染小鼠,取胃组织,检测尿素酶活性。4.应用SPSS 21.0软件对实验数据进行统计分析,计量资料以`x±s表示,组间差异采用单因素方差分析,各组间两两比较采用最小显著差异法(Least significant deviation,LSD),以P<0.05为差异具有统计学意义标准。结果1.lpp20和lt B基因的PCR扩增产物长度均与预期相符,分别为548 bp和334 bp。2.用lpp20和lt B分别与p NZ8149-SP连接后,转化L.lactis NZ3900菌株,筛选出两种重组菌株,PCR、酶切及测序结果显示菌株构建正确。3.SDS-PAGE分析显示,重组菌株经诱导后,Lpp20主要表达为胞内蛋白,但通过Western blot分析在菌体蛋白和培养基上清蛋白中均可检出Lpp20表达;LTB主要表达为分泌性蛋白,在培养基上清蛋白中被检出。4.动物实验:(1)血清Ig G抗体:Lpp20组与NZ3900组、Lpp20+LTB组与NZ3900组、Lpp20组与PBS组、Lpp20+LTB组与PBS组、Lpp20组与Lpp20+LTB组差异均具有统计学意义(P<0.05);(2)肠道SIg A抗体:Lpp20+LTB组与Lpp20组、Lpp20+LTB组与NZ3900组、Lpp20+LTB组与PBS对照组差异具有统计学意义(P<0.05);Lpp20组与NZ3900组、Lpp20组与PBS组差异无统计学意义(P>0.05);(3)胃组织尿素酶活性:Lpp20组与NZ3900组、Lpp20组与PBS组、Lpp20+LTB组与NZ3900组、Lpp20+LTB组与PBS组差异均具有统计学意义(P<0.05),Lpp20组与Lpp20+LTB组差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.成功构建Lpp20和LTB的乳酸菌表达系统L.lactis NZ3900/p NZ8149-SP-lpp20和NZ3900/p NZ8149-SP-lt B,并检出重组蛋白的表达和抗原活性。2.NZ3900/p NZ8149-SP-lpp20菌株具有免疫原性,经口免疫小鼠可引起系统免疫和黏膜免疫反应,减少胃部Hp定植,在疫苗研究中具有应用潜力。3.NZ3900/p NZ8149-SP-lt B菌株可增强口服疫苗激发的黏膜免疫反应,可成为黏膜免疫佐剂的新来源。