前言:急性髓系白血病(AML)和弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL)是血液科常见的恶性增殖性疾病,严重威胁人民健康。尽管目前所应用的抗肿瘤综合治疗已经在很大程度上提高了临床疗效、改善了患者预后,但这些治疗仍不能有效地减少上述两种疾病的复发及控制疾病的进展。近年来随着分子生物学的不断发展,疾病发生、发展、转归、耐药等生物学过程的机制研究逐渐深入,许多新的肿瘤治疗靶点不断涌现,为精准治疗提供了实验基础。在淋巴瘤的诊断领域,许多新的预后指标的出现也为淋巴瘤的治疗提供了重要参考。从临床实际问题出发,以临床实际治疗方案、病例信息为依托,寻找疾病诊断、治疗中的关键分子,将为全新治疗方法的开发提供实验基础。2015年1月,美国总统奥巴马在国情咨文演讲中提出了“精准医疗计划”,希望通过分析100多万美国志愿者的基因信息,从基因组层面认识和了解疾病,寻找出疾病的致病原因和治疗靶点,为开发靶向药物和实现精准施药铺平道路,以期治愈癌症等疾病。人类的常见疾病,如恶性肿瘤、神经退行性疾病等的发生、发展、转归及耐药的根本原因都可以归结为基因的异常表达。因此,如何准确识别并调控异常基因的表达水平成为疾病治疗的关键之一。近年来,随着针对不同肿瘤的靶向治疗药物的不断出现及广泛的临床应用,恶性肿瘤性疾病的治疗效果得到了很大提升。靶向治疗药物通过调控靶标基因的表达水平来达到治疗疾病的目的,在精准医疗中发挥着非常重要的作用。然而,靶标基因的发现往往依赖于科研人员的实验经验,通过对目的基因的筛选和生物学实验来验证猜测的真伪。这种“经验主义”的方法导致了筛选基因的命中率过低,既造成了时间、人力和物力的浪费,又很可能导致关键基因的遗漏。原因在于:每个基因往往都不是孤立的,一个基因既能影响其它基因的表达,又受其它基因的影响。基因组内相互影响、相互制约的调控关系构成了包含数万个基因、数千万种基因间非线性调控关系的全基因组调控网络,复杂程度已远远超出大脑的推理能力。因此,分析全基因组调控网络,可以发现基因对之间作用关系、基因上下游调控网络、多基因共同信号通路和信号旁路的关键基因等信息,为疾病的发病机制、治疗策略等提供参考。本论文从急性髓系白血病和弥漫大B细胞淋巴瘤两个方面对我们既往开展的有关上述两种疾病生物学行为相关基因以及调控网络分析、建立等研究工作做以汇报。材料与方法:1、细胞系及病例组织标本:急性髓系白血病研究中所用细胞系为:急性髓系白血病细胞系人急性单核细胞白血病细胞THP-1(3111C0001CCC000057)、人急性早幼粒白血病细胞HL-60(3111C0001CCC000037)均购自国家实验细胞资源共享平台(中国,北京);急性粒细胞白血病部分分化型(M2)细胞Kasumi-6购自ATCC细胞库。弥漫型大B细胞淋巴瘤研究中病例标本来自于2001年1月至2007年12月31日之间在中国医科大学第一医院、中国医科大学第四医院和辽宁省肿瘤医院接受治疗的、病理诊断为DLBCL的患者。治疗前通过体格检查、骨髓活检、胸部CT和腹部CT评估病灶转移。病例根据Ann Arbor系统分期。淋巴节外部位侵犯和较大肿块的直径亦作为评估因素。所有病人签署了书面知情同意书,研究协议和样本收集通过了中国医科大学伦理委员会批准。2、方法:急性髓系白血病研究所用主要实验方法:急性髓系白血病细胞系凋亡检测通过膜联蛋白V-FITC和碘化丙啶(PI)的双染进行,自发性凋亡细胞的比率应用流式细胞技术测定。细胞系的转染应用脂质体(Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)将siRNAs转染到经过纯化的AML细胞中。蛋白印迹分析在EZH2-si和EZH2-c AML细胞转染48h后收集进行,目标蛋白与内参蛋白(GAPDH)的相对浓度用ImmuNe software来分析。弥漫型大B细胞淋巴瘤研究所用主要研究方法:应用免疫组织化学法检测淋巴瘤病理切片中SPRR1A蛋白表达含量,根据以下标准作半定量分类:0:<1%的细胞离散表达SPRR1A;1+:≥1且<10%的细胞离散表达SPRR1A;2+:≥10%的细胞离散表达SPRR1A。评分为1+或2+的样本被认为是阳性。3、统计学处理:急性髓系白血病研究中数据采用GraphPad Prism 5进行作图及统计分析,计量数据的组间比较采用t检验。弥漫大B细胞淋巴瘤研究中数据采用SPSS 19.0统计软件包进行处理。SPRR1A的表达与临床病理参数的相关性采用Pearson卡方检验进行。总体生存期(Overall survival,OS)采用Kaplan–Meier方法计算,组间生存差异采用log-rank检验进行比较。Cox回归模型用于进行单变量及多变量的独立危险因素筛选。P<0.05定义为具有统计学意义。本研究在预实验阶段对乳腺癌相关基因进行研究,构建出基因调控网络并进行分析。首先,将计算两个基因间的互信息表达式利用高斯核函数概率分布简化为只计算其协方差的形式;其次,在乳腺癌基因表达数据中寻找了若干个相关基因进行调控网络建模分析;再次,通过分析基因调控网络找到连通度最高的基因做为关键基因;最后,在关键基因和它所连通的所有基因中,寻找已推出靶向药物。这些基因和靶向药物对乳腺癌在靶向治疗手段中提供了有价值的参考。基于上述基因调控网络分析工作基础,我们进一步对白血病和淋巴瘤中的相关关键基因及其调控网络进行了分析和验证。结果:急性髓系白血病研究结果:我们比较了人急性单核细胞白血病细胞THP-1、人急性早幼粒白血病细胞HL60和急性粒细胞白血病部分分化型(M2)细胞Kasumi-6等细胞系细胞经过10μM三氧化二砷处理72小时前后EZH2蛋白表达量的改变情况。Western-blot检测结果表明在三氧化二砷处理后,EZH2蛋白的表达量明显提升。经过三氧化二砷处理后,上述三种急性髓系白血病细胞系细胞中凋亡细胞的比例明显增加。在三氧化二砷处理的EZH2敲除的THP-1、HL60、Kasumi-6细胞中,我们观察到白血病细胞的凋亡率明显增加,表明敲低EZH2的表达能够显著增加急性髓系白血病细胞对三氧化二砷所诱导的凋亡的敏感性。在应用乳腺癌基因芯片数据构建基因调控网络阶段,首先,我们计算了两个基因间的相互作用关系,将高斯核函数概率分布简化为只计算其协方差的形式;其次,在乳腺癌基因表达数据中寻找了340个相关基因进行调控网络建模分析;再次,通过分析基因调控网络找到连通度最高的5个基因做为关键基因;最后,在关键基因及其所连通的所有基因中,共发现了22个已推出靶向药物的基因。基于上述工作基础,我们进一步对白血病和淋巴瘤中的相关关键基因及其调控网络进行了分析和验证。我们发现DACT3、TBX5、SERBP1、IQGAP3、DEK以及CDCA7、KLHL23、TMPO、TIA1、CASP2、MTPAP、PAK1IP1等共12个基因与EZH2之间存在显著关联,并可能参与了Wnt/β-catenin、MAPK、PI3K/AKT/mTOR、HIPPO、CASP2-AMPK-AKT-mTOR、CASP2-AMPK-MAPK等相关重要信号通路,涉及EMT、自噬、凋亡等多种重要的肿瘤相关生物学行为。通过Western-blot检测,我们发现在EZH2-si敲低人急性单核细胞白血病细胞THP-1、人急性早幼粒白血病细胞HL60和急性粒细胞白血病部分分化型(M2)细胞Kasumi-6中,多种蛋白的表达水平发生了显著变化,其中磷酸化与和非磷酸化GSK-3β的比率明显较对照组EZH2-c细胞为低,说明EZH2在这些白血病细胞中可以促进GSK-3β的磷酸化,这提示其可能参与到经典的Wnt/β-catenin通路的激活过程中。弥漫型大B细胞淋巴瘤研究结果:在967例患者中,共有305例(32%)组织样本中的SPRR1A蛋白的染色结果为阳性。全部临床病理特征在两组(SPRR1A阴性组和SPRR1A阳性组)之间的分布无显著统计学差异。在SPRR1A阳性组中,患者的5年生存率为26.9%(95%CI,21.6%-95%),较之于SPRR1A阴性组的53.2%(95%CI,48.9%-95%),生存时间明显缩短(P<0.001)。我们应用多因素回归方法,发现SPRR1A表达状态、临床分期、乳酸脱氢酶水平等因素为弥漫型大B细胞淋巴瘤患者的独立预后因素,其中SPRR1A阳性组的死亡风险比为1.564(95%CI,1.337-2.464;P=0.013)。我们分析了SPRR1A相关基因,筛选出了SSTR5、NYX、TMEM204、VRTN、BIN1、BCAT2、ODF3L2等7个SPRR1A相关关键基因。结论:我们的研究表明在急性髓系白血病细胞中EZH2蛋白的表达可能会抑制三氧化二砷所诱导的白血病细胞的凋亡,而EZH2蛋白在三氧化二砷治疗急性髓系白血病的过程中,或许可作为一个新的药物增敏靶点。我们的研究发现为三氧化二砷和EZH2调控急性髓系白血病的生物学过程提供了新的思路与方向。在弥漫型大B细胞淋巴瘤组织中,SPRR1A蛋白的表达具有显著差异。SPRR1A蛋白表达阳性患者的预后较差,其表达状态可能是弥漫型大B细胞淋巴瘤的潜在独立预后因素。