背景及目的：肺纤维化是一种严重的、慢性进行性的以弥漫性的肺泡炎、肺泡壁的增厚以及大量的细胞外基质沉积为特征的间质性肺疾病,目前尚缺乏有效的治疗措施。其主要的组织学特点为持续的难以修复的肺泡上皮的损伤、过度增生及聚集的成纤维细胞和肌成纤维细胞以及大量的细胞外基质沉积。其具体的发病机制仍不十分明确。持续的慢性损伤可引起成纤维细胞激活,分泌大量的细胞因子、趋化因子以及细胞外基质,促进肺纤维化的发生、发展,因此,研究成纤维细胞产生细胞外基质的机制并进行阻断对延缓肺纤维化的发生发展具有重要的意义。肾素-血管紧张素系统(Renin Angiotensin System, RAS)参与了肺纤维化的发生、发展过程。血管紧张素Ⅱ(Angiotensin Ⅱ. AngⅡ)是RAS里面的主要效应分子,可和其Ⅰ型受体(AngⅡ type Ⅰ receptor, AT1R)结合促进细胞外基质的沉积以及成纤维细胞的增值和迁移等。血管紧张素转化酶2(Angiotensin converting enzyme 2, ACE2)/血管紧张素1-7 (Angiotensin(1-7)/Mas受体轴是最新发现的血管紧张素系统的新组分,Ang(1-7)由Ang Ⅱ在ACE2的作用下产生,与Mas受体结合后具有拮抗ACE/AngⅡ/AT1受体轴的作用。近年来的研究发现,氧化应激参与了肺纤维化的发展过程。氧化应激(Oxidative Stress)是指当机体遭遇各种有害刺激时,体内氧化与抗氧化反应失衡,活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)产生过多,超出机体的清除能力,导致细胞功能紊乱及组织损伤。研究证明,氧化应激的水平与肺纤维化患者肺功能情况呈负相关关系,特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)患者肺泡灌洗液中脂质过氧化物及过氧化氢的产生较正常对照组明显增多,提示氧化/抗氧化失衡在肺纤维化中具有重要的地位。有文献报道,Ang Ⅱ通过与AT1受体结合后可以激活NADPH氧化酶,使ROS产生增多,进而广泛引起血管炎症反应及纤维化的发生。因此,我们猜测,在肺脏中,Ang Ⅱ可能通过激活NOX4引起肺纤维化的发生。通过研究AngⅡ对肺纤维化的作用靶点,阻断其发挥作用的途径,可以为治疗肺纤维化提供新的理论依据。最新的研究发现,NALP3炎症体在肺纤维化的发生过程中具有重要地位。NALP3炎症体是一个多蛋白复合体,它由NALP3、ASC、caspase1三种蛋白组成。受到ROS、病原微生物等有害刺激后,引起NALP3炎症体激活,使成熟的IL1β、(cleave IL1β)、IL18分泌增多。研究发现,NALP3基因缺陷小鼠可以明显减轻二氧化硅诱导的炎症反应及胶原沉积,而NALP3基因过表达小鼠与野生型小鼠相比其胶原沉积更为明显,这些均提示NALP3炎症体参与了肺纤维化的发生。然而,AT1受体拮抗剂氯沙坦可以抑制LPS介导的ILlp的分泌,同时抑制NALP3和caspase1 mRNA的表达水平。因此,我们猜测,AngⅡ通过与AT1受体结合后可能能够引起NALP3炎症体的激活,但其具体机制仍有待进一步研究。本课题组的前期实验已证实,AngⅡ通过激活NOX4/ROS/Rock2信号通路促进原代肺成纤维细胞的胶原合成,加重博来霉素(bleomycin, BLM)诱导的肺纤维化,Ang(1-7)可通过抑制NOX4/ROS/Rock2信号通路的活性减轻BLM诱导的肺纤维化。然而,AngⅡ及Ang(1-7)对NALP3炎症体的影响仍不清楚,AngⅡ能否通过调节NOX4激活NALP3炎症体促进原代肺成纤维细胞的胶原合成,而Ang(1-7)能否通过抑制NOX4/NALP3炎症体信号通路减轻肺纤维化的程度,这些问题的回答有待本实验进一步阐释。方法：1、体外实验：(1)使用组织贴壁法分离培养大鼠原代肺成纤维细胞,利用Vimentin免疫荧光染色进行鉴定。(2)检测AngⅡ刺激0h、12h、24h、36h、48h后原代肺成纤维细胞内活性氧水平。(3)检测AngⅡ刺激0h、12h、24h、36h、48h后原代肺成纤维细胞内过氧化氢水平。(4)检测不同浓度(10-9、10-7、10-5mol/l) AngⅡ刺激原代肺成纤维细胞24小时后检测细胞内caspase1活性。(5)检测不同浓度(10-9、10-7、10-5mol/l) AngⅡ刺激原代肺成纤维细胞24小时后检测细胞上清液IL1β水平。(6)免疫荧光双染检测原代肺成纤维细胞内NALP3、caspase1、ASC的表达。(7)Western blotting检测不同处理后原代肺成纤维细胞内NOX4、α-collagen Ⅰ、NALP3、pro-caspase1、caspasel p10、IL1β、cleave IL1β蛋白的表达水平2、体内实验：将48只体重约为200g左右的雄性wistar大鼠随机分成4组,每组12只：Control组：经气管内滴入生理盐水200μl BLM组：经气管内滴入博来霉素(5mg/kg); BLM+Ang(1-7)组：经气管内滴注博来霉素(5mg/kg),同时于皮下埋入装有Ang(1-7)药物的微量,泵持续泵入(25μg · kg-1 μ h-1); BLM+AngⅡ组：经气管内滴注博来霉素(5mg/kg),同时于皮下埋入装有AngⅡ的微量泵,持续泵入(25μg·kg-1 μh-1)。4周后取肺组织行NOX4+α-SMA、NALP3+α-SMA免疫荧光双染,使用Western blotting检测NOX4、α-collagen Ⅰ、NALP3、pro-caspase1、caspasel p10、IL1β、cleave IL1β蛋白的表达水平。3、统计学方法：应用SPSS 13.0统计学软件进行统计学处理,结果数据以均数±标准差(x±s)表示。采用One-way ANOVA方差分析法,首先利用Levene方法进行方差齐性检验,满足方差齐性时多重比较采用LSD法,不满足方差齐性时多重比较采用Dunnett’s T3法,以P<0.05表示差异有统计学意义。结果1、大鼠原代肺成纤维细胞的形态学鉴定及荧光鉴定。肺组织贴壁2-4天后可于显微镜下观察到细胞逐渐从组织块周围爬出,原代肺成纤维细胞形态呈星状或梭形,胞质透亮,核圆形或椭圆形,核仁明显,细胞之间相互连接紧密,边缘光滑。对原代培养的肺成纤维细胞行免疫荧光染色可见细胞均可表达波形蛋白(vimentin,成纤维细胞特有的标志性蛋白)。2、Ang Ⅱ促进原代肺成纤维细胞胶原的合成。AngⅡ (10-7mol/1)分别刺激原代肺成纤维细胞0、24、36、48小时后通过western blotting检测细胞CTGF以及胶原(α-collagen Ⅰ)的合成。可见AngⅡ在24小时开始即可明显促进CTGF及胶原的产生,且在36小时的时候到达高峰(均P<0.05)。3、AngⅡ促进氧化反应的发生。浓度为10-7mol/1的Ang Ⅱ分别作用于细胞0h、12h、24h、36h、48h后检测细胞内ROS、H2O2以及NOX4蛋白的表达。ROS检测结果显示,AngⅡ处理12h后ROS即可升高,到36h达高峰(均P<0.05)。H202检测结果显示,AngⅡ处理24 h后H202明显升高,到36h达高峰(均P<0.05)。同样,通过Western blotting检测细胞内NOX4的表达,可见24 h时NOX4表达明显升高,到36 h达高峰(均P<0.05)。4、AngⅡ通过激活NOX4促进肺成纤维细胞胶原的合成。AngⅡ处理肺成纤维细胞后能够明显增加NOX4及胶原的表达,然而,NAC和DPI预处理细胞能够在抑制NOX4的同时显著抑制Ang II诱导的肺成纤维细胞胶原的合成(均P<0.05)。此外,通过转染NOX4 siRNA抑制NOX4蛋白的表达后,可见AngⅡ诱导的胶原合成也同样是显著降低的(P<0.05)。5、AngⅡ激活NALP3炎症体。免疫荧光染色结果显示,Ang Ⅱ刺激肺成纤维细胞后NALP3炎症体的各个组分(NALP3, Caspase1, ASC)荧光强度明显增高,同时,荧光结果显示,NALP3 与 Caspase1、ASC与NALP3这两种蛋白之间相互重合增加。另外一方面,Ang Ⅱ刺激后NLRP3炎症体的各个组分(NALP3, Caspase1, ASC)与代表线粒体的蓝色荧光的重合也是明显增加的,提示线粒体参与了NALP3炎症体的激活过程。Western blotting结果显示,AngⅡ能够显著促进NALP3的表达,同时,caspasel的活性成分p10、IL1D的活性成分cleave IL 1β的表达也显著高于对照组(P<0.05)。Caspase1活性的检测、细胞培养上清液IL1β的Elisa检测均提示AngⅡ能够显著增加这些活性成分的表达(均P<0.05)。6、Ang n通过激活NALP3炎症体促进肺成纤维细胞胶原的合成。Ang Ⅱ处理肺成纤维细胞后能够明显增加NALP3炎症体各组分蛋白(NALP3、caspase1、caspasel p10、IL1β和cleave IL1β)及胶原的表达,然而,caspasel抑制剂AC-YVAD-CMK预处理细胞能够在抑制caspasel p10的同时显著抑制AngⅡ诱导的肺成纤维细胞胶原的合成(均P<0.05)。此外,通过转染NALP3 siRNA抑制NALP3蛋白的表达后,可见AngⅡ诱导的胶原合成也同样是显著降低的(P<0.05)。7、AngⅡ通过NOX4/NALP3炎症体通路促进肺成纤维细胞胶原的合成。NAC和DPI能够明显抑制NALP3炎症体各组分蛋白(NALP3、IL1β和cleaveILlβ)的表达(均P<0.05)。此外,通过转染NOX4 siRNA抑制NOX4蛋白的表达后,可见Ang Ⅱ诱导的NALP3炎症体各组分蛋白(caspase1、caspasel p10、 IL1β和cleave IL1β)胶原合成也同样是显著降低的(P<0.05)。8、Ang(1-7)通过抑制NOX4/NALP3炎症体通路减少AngⅡ诱导的胶原合成。Western blotting结果显示,AngⅡ可以明显诱导肺成纤维细胞α-collagen Ⅰ、 NOX4、NALP3以及cleave IL1β蛋白的表达(均P<0.05),联合Ang(1-7)处理后,α-collagen Ⅰ、NOX4、NALP3以及cleave IL1p蛋白表达水平较单纯AngⅡ刺激明显下降,其作用与联合使用AT1受体抑制剂Irbesartan的作用类似(均P<0.05)。另一方面,联合使用Mas受体抑制剂A779能够阻断Ang(1-7)对AngⅡ的抑制作用,使α-collagen Ⅰ、NOX4、NALP3以及cleave IL1β蛋白表达水平明显上升(均P<0.05)。与Ang Ⅱ+Ang(1-7)联合组不同,单独的Ang(1-7)同样能够促进N OX4、NALP3以及cleave IL1β蛋白表达水平(均P<0.05)。9、Ang(1-7)及AngⅡ对博来霉素诱导的大鼠肺纤维化的影响。9.1 Ang(1-7)及AngⅡ对博来霉素诱导的大鼠NOX4表达的不同影响。免疫荧光结果显示,在BLM组大鼠肺组织内,在纤维化形成的肺间质中,NOX4蛋白荧光强度明显增强,与αSMA蛋白重叠区域增多。BLM+AngⅡ组中,肺纤维化程度较单纯BLM组加重,且NOX4荧光强度也明显增强,与αSMA蛋白重叠区域也更多。而BLM+Ang(1-7)组中,纤维化程度减弱,NOX4的荧光强度明显下降,与αSMA蛋白重叠减少。Western blotting结果显示,BLM组NOX4蛋白较control组明显升高,BLM+AngⅠⅠ组升高更为明显,而BLM+Ang(1-7)组较BLM组显著下降(均P<0.05)。α-collagen Ⅰ蛋白的表达具有相同的变化趋势(均P<0.05。)9.2Ang(1-7)及Ang Ⅱ对博来霉素诱导的大鼠NALP3炎症体的不同影响。免疫荧光结果显示,BLM组大鼠肺组织NALP3染色细胞明显增多,荧光强度增加,且部分与a-SMA染色阳性细胞共染。BLM+Ang Ⅱ组中NALP3染色细胞增多更为明显,且a-SMA染色阳性细胞共染区域更多。而BLM+Ang(1-7)组中NALP3的荧光强度明显下降,与αSMA染色阳性细胞共染区域减少。Western blotting结果显示,BLM组NALP3蛋白较control组明显升高,BLM+AngⅡ组升高更为明显,而BLM+Ang(1-7)组较BLM组显著下降(均P<0.05)。Caspase1 p10、cleave ⅠL1p蛋白的表达具有相同的变化趋势(均P<0.05)。结论：1.AngⅡ可通过NOX4激活NALP3炎症体,促进原代肺成纤维细胞胶原的合成。2.Irbesartan和Ang(1-7)均可抑制AngⅡ对NOX4/NALP3炎症体信号通路的激活,减少肺原代成纤维细胞胶原的合成。3.单独的Ang(1-7)可促进原代肺成纤维细胞NOX4/NALP3炎症体信号通路。4.AngⅡ通过激活NOX4/NALP3信号通路加重BLM诱导的肺纤维化,而Ang(1-7)通过抑制NOX4/NALP3信号通路减轻BLM诱导的肺纤维化。