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侵袭性曲霉病是由曲霉菌侵染造成的真菌病害,其发病率和死亡率很高,唑类药物抗性的产生已成为医学治疗侵袭性曲霉病的一大威胁,烟曲霉抗药现象、抗性机制及抗性产生的根源已经成为全球关注的热点。越来越多的证据指向临床抗性烟曲霉源于环境中农用杀菌剂的使用。 从浙江省嘉兴市和绍兴市的主要蔬菜种植区分离出若干烟曲霉(Aspergillusfumigatus),以中科院微生物菌种保藏中心购买一株烟曲霉(A.fumigatus)CMI45338作为对照菌株,对所有菌株进行多菌灵敏感性测定。结果发现分离株对多菌灵均表现出高抗性,而菌株CMI45338为低抗菌株。不同甾醇生物合成抑制剂的交互抗性分析结果表明,抗多菌灵烟曲霉对奥硝唑、甲硝唑、罗硝唑、替硝唑、塞克硝唑、地美硝唑均表现交互抗性。 抗性烟曲霉对多菌灵、奥硝唑、甲硝唑、罗硝唑、替硝唑、塞克硝唑、地美硝唑有不同程度的代谢作用,菌株YT对多菌灵、奥硝唑、地美硝唑和塞克硝唑的代谢能力最强,10天内的代谢率分别达到20.81%、75.11%、11.74%、25.33%;菌株SX-4对甲硝唑的代谢能力最强,代谢率30.16%; SX-26对罗硝唑的代谢能力最强;SX-8b、SX-S-6对唑类药剂的解毒代谢能力最弱;其余菌株对替硝唑的代谢能力相近。 通过对多菌灵和奥硝唑的代谢产物HPLC-MS-MS分析,前者主要产物为2-氨基苯并咪唑和2-羟基苯并咪唑,并可能进一步代谢为苯丙咪唑和邻苯二酚,失去咪唑环的多菌灵失去了与麦角甾醇结合位点,导致对烟曲霉的毒性下降。奥硝唑的主要产物2-甲基-5-氨基咪唑和1-(2-羟丙基)-2-甲基-5-硝基咪唑,5位的硝基被还原为氨基,分子中的醇羟基丢失,均大大降低了奥硝唑的抗真菌活性。 通过多菌灵高抗和低抗的烟曲霉14α-脱甲基酶(CYP51)基因全序列分析,低抗菌株cyp51A基因未发现氨基酸突变,高抗型菌株cyp51A基因均发现核苷酸突变,突变位点集中在:V40G、G54V、G54E、M236V、N248T、S297T;其中G54位于CYP51蛋白高度保守域,为突变热点,297(丝氨酸)位于SRS4高度保守域,初步推测以上位点的差异与药剂的抗药性有直接的关系。 在纯培养条件下,将高抗菌株NX-1恢复培养转变为低抗菌株,且恢复菌株对奥硝唑等咪唑类抗真菌药物的抗性下降,表明该菌株抗药性具有恢复敏感性;低抗菌株CMI45338在多菌灵诱导作用下,抗性增强,对奥硝唑等产生了交互抗性。 试验结果初步证明田间抗性烟曲霉并非自然存在,可能是田间施用唑类杀菌剂的选择压之下产生的,抗农用唑类杀菌剂烟曲霉同样对结构类似的医用唑类抗真菌药物具有抗性。