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肿瘤疫苗是利用肿瘤抗原诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫应答，以调节机体免疫功能，达到治疗肿瘤的目的。肿瘤疫苗包括肿瘤细胞瘤苗、DC瘤苗、抗原肽疫苗、蛋白疫苗，核酸疫苗等。核酸疫苗，主要指DNA疫苗，因其免疫原性低、安全、可重复使用、制备和储存方便，主要诱导细胞免疫应答等优势而成为肿瘤特异性免疫治疗中一种极具吸引力的新型疫苗。但DNA疫苗的不足之处是其诱导的免疫应答水平不够高，因此如何构建新型高效抗肿瘤DNA疫苗已经成为肿瘤免疫治疗研究的热点。 肿瘤特异性免疫治疗的关键是发现并鉴定肿瘤特异性抗原。MAGE-3基因的表达产物是一种肿瘤排斥抗原，只在肿瘤、睾丸、胎盘中表达，在正常体细胞中不表达，而睾丸和胎盘是封闭性组织，且不表达MHC-Ⅰ类分子，以MAGE-3为基础制成的疫苗可以杀伤多种肿瘤细胞，而对正常细胞无影响，MAGE-3分子内含有多个MHC-Ⅰ类分子限制的表位和MHC-Ⅱ类分子限制的表位，因此MAGE-3在抗肿瘤免疫中是一个理想的靶抗原。 近年来研究发现，热休克蛋白具有抗原递呈功能，能将肿瘤细胞内的抗原信息传递至细胞膜上，进而诱导机体产生特异性抗肿瘤免疫应答。从肿瘤组织中提取的HSP-肽复合物能诱导抗肿瘤免疫应答，体外构建的HSP-肽复合物或HSP-抗原融合蛋白具有同样的作用。但从正常组织提取的HSP复合物未能诱导出抗肿瘤免疫应答。HSP-肽复合物中具有免疫原性的是与HSP结合的肽，而非HSP本身。HSP-肽复合物诱导的免疫应答可不受MHC限制。因此以HSP为基础的肿瘤疫苗是目前肿瘤疫苗研究中的热点。 本研究利用HSP70的抗原递呈功能和分子佐剂作用，以及MAGE-3的肿瘤抗原特异性，构建pcDNA3.1／HSP70-MAGE-3融合DNA疫苗，以提高MAGE-3的抗原性，更有效地激发MAGE-3特异性的抗肿瘤免疫应答，最终达到杀伤MAGE-3阳性肿瘤细胞的目的。 浙江大学博士学位论文第一部分peDNA3.1/HSP70，pcDNA3.1/HSP70weMAGE一3真核表达载体的构建目的:构建重组真核表达质粒poDNA3.1/HSP70，pcDNA3.1/HSP70一MAGE一3。方法:通过RT一PCR扩增HSP70全长编码序列，经T一A克隆并测序，将测序结果正确的HSP70 cDNA亚克隆至peDNA3.1和peDNA3.1/MAGE一3质粒，限制性内切酶切割鉴定。结果:HSP70 RT一PCR产物T一A克隆的测序结果与GenBank内的序列完全一致，重组质粒pcDNA3.1/HSP70一MAGE一3，PcDNA3.1/HSP70经酶切鉴定能切出目标片段。结论:成功构建了重组真核表达质粒PeDNA3.l/HSP70，peDNA3.1/HSP70一MAGE一3。第二部分脂质体介导真核表达质粒转染及在真核细胞中的表达目的:鉴定重组真核表达质粒peDNA3.l/HSP70，peDNA3.l/HSp70一MAGE一3，peDNA3.z/以GE一3能否在真核细胞内有效表达。方法:peDNA3.l/HSP70，peDNA3.1/HSP70一MAGE一3，PcDNA3.1/MAGE一3通过脂质体介导转染小鼠黑色素瘤B16细胞株，采用RT一PCR、免疫细胞化学染色及western blot鉴定其表达。结果:转染细胞分别经HSP70或MAGE一3 RT一PCR扩增，能扩增出目标片段，用HSP70一抗或MAGE一3一抗行免疫细胞化学染色，细胞浆呈棕色，Western blot鉴定有相应的特异性条带出现。结论:重组真核表达质粒pCDNA3.1/HSP70，peDNA3.1/HSP70一MAGE一3，peDNA3.1/MAGE一3能在B16细胞内有效表达。第三部分转染重组真核表达质粒对B16细胞体内外生长的影响目的:体内和体外观察转染peDNA3.z/HSP70，pcDNA3一/HSP70一MAGE一3，peDNA3.1/MAGE一3B16细胞的生长情况。方法:细胞计数法体外制备细胞生长曲线;各组以5 x IJ个细胞接种C57BL/6小鼠，观察肿瘤生长情况、脾淋巴细胞CTL杀伤活性、脾细胞培养上清IL一2、IFN一Y浓度及鼠血清中抗MAGE一3抗体水平。结果:转染了pcDNA3.1/HSP7O一拟GE一3、PcDNA3.1/MAGE一3、PcDNA3.l/HSP7O的B16细胞与对照组相比，体外生长曲线趋势相似;体内接种5x1O5个各组B16细胞后，成瘤时间无明显差异，但至40天时，转染PcDNA3.1/HSP7O一撇GE一3组肿瘤体积明显小于其它对照组，其脾淋巴细胞表现出明显的 浙江大学博士学位论文MAGE一3特异性杀伤活性，脾细胞培养上清中工L一2和工FN一丫的表达明显增加，血清中未检测到抗MAGE一3抗体。结论:体外，转染pcDNA3.l/HSP7O-MAGE一3、pcDNA3.l/MAGE一3、peDNA3.1/HSP70后，并未影响B16细胞的倍增时间。体内，peDNA3.l/HSP70一MAGE一3转染的B16细胞，能诱导MAGE一3特异性抗肿瘤细胞免疫应答，抑制肿瘤生长。第四部分pcDNA3.l/HSP7O一MAGE一3融合DNA疫苗诱导的免疫应答目的:观察pcDNA3.1/HSP70一MAGE一3 DNA疫苗诱导MAGE一3特异性免疫应答的能力。方法:以100拼g裸质粒DNA疫苗直接小鼠大腿肌肉注射，共2或3次，间隔7天，检测外周血淋巴细胞亚群变化、脾淋巴细胞CTL杀伤活性、脾细胞培养上清IL一2、IFN一丫浓度及鼠血清中抗MAGE一3抗体水平。结果:p。DNA3.l/HSP7O一MAGE一3及poDNA3.1/M AGE一3 DNA疫苗免疫组，其脾淋巴细胞表现出明显的MAGE一3特异性CTL杀伤活性，脾细胞培养上清中工L?