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目的:研究内皮微粒(EMP)在鉴别肾移植术后急性排斥反应(AR)和慢性环孢素肾病(CCN)中的意义,并通过体外研究观察EMP对单核细胞功能的影响,探索EMP在CCN发病机制中可能存在的作用。方法:(第一部分)1.构建大鼠肾移植模型:在参考已有大鼠肾移植模型构建方法的基础上,分别对动、静脉吻合方式进行适当改进,成功构建了大鼠原位肾移植模型。2.实验动物分组及标本采集:(1)同种同基因组移植对照组(Control-7days组,n=9):供、受体均为SD大鼠。(2)同种异基因移植7天组AR组(AR 7days组,n=8):供体为Wistar、受体为SD大鼠。(3)同种同基因移植术后环孢素7天组(CsA -7days,n=9):供、受体均为SD大鼠。(4)同种同基因移植术后环孢素28天组(CsA -28days组,即CCN组,n=8):供、受体均为SD大鼠;实验大鼠按照时间点分别于造模成功时经腹主动脉取抗凝血5ml,高速离心分离得到含EMP血浆,-80℃保存,同时摘取供肾,10%中性甲醛固定。3.通过HE染色方法检测移植肾脏组织病理学改变,Banff 97分级评分标准,确定模型构建成功与否。4.模型动物循环EMP的表型分析:应用流式细胞术检测APC-CD144/PE-CD62E双阳性EMP和PE-perforin/APC-CD144双阳性EMP在APC-CD144阳性EMP总数中的百分比的差异,结果分别用CD144+CD62E+EMP%和CD144+perforin+EMP%表示。方法:(第二部分)1.免疫组织化学方法检测第一部分实验中CsA-28days组(CCN模型)和对照组(Control-7days)动物模型肾脏组织中ED-1抗原的表达差异。2.体外EMP的产生与计数:CsA刺激培养的人脐静脉内皮细胞株EAhy926产生EMP,用流式细胞术分析CD144阳性EMP的数量。3.CsA刺激产生的EMP对人单核细胞株THP-1细胞的影响:按THP-1细胞与EMP的数量的比例关系分组,另设50μg/ml LPS作为阳性对照组,D-Hanks作为阴性对照组,分组为:①空白对照组(加入等体积的D-Hanks作为Control组)②低浓度EMP组(1:25 EMP组)③中浓度EMP组(1:50 EMP组)④高浓度EMP组(1:100 EMP组)⑤50μg/L LPS阳性对照组。应用ELISA方法测定各组THP-1细胞分泌TNF-α的水平,同时应用RT-PCR技术检测各组THP-1细胞MCP-1mRNA、HLA-DR mRNA、CCR2 mRNA表达水平的差异。各种结果的差异应用SPSS 18.0软件统计分析,P值均<0.05。结果(第一部分):1.成功构建大鼠原位肾移植模型,病理结构显示所构建的AR模型和CCN模型符合文献诊断标准。2.各实验组血浆CD144+CD62E+EMP%表型差异结果(χ±SD):(1)Control-7days组(n=9):(28.11±6.37)%;(2)AR-7days组(n=8):(60.75±5.90)%;(3)CsA -7days组(n=9):(33.78±7.82)%;(4)CsA -28days组(n=8):(75.37±8.00)%;基本趋势是:(4)>(2)>(3)≥(1)。3.各实验组血浆CD144+perforin+EMP%表型差异结果((Norling, Tufro-McReddie et al. 1996)χ±SD):(1)Control-7days组(n=9):(10.67±2.24)%;(2)AR 7days组(n=8):(20.37±2.77)%;(3)CsA -7days组(n=9):(11.44±3.17)%;(4)CsA -28days组(n=8):(15.38±3.02)%。基本趋势是:(2)>(4)≥(3)≥(1)。结果(第二部分):1.与Control组相比,大鼠环孢素肾病模型(CCN组)移植肾组织中发现大量ED-1阳性单核巨噬细胞浸润。2.EMP刺激THP-1细胞MCP-1 mRNA、HLA-DR mRNA、CCR2 mRNA以及TNF-α表达水平的差异:与D-Hanks Control组相比,上述指标的量随着EMP数量的升高而升高,且1:100组、1:50 EMP组与Control差异具有显著性,P<0.05,而1:25 EMP组差异不明显。结论:1.体内研究发现CD144~+ perforin~+ EMP和CD144~+ CD62E~+ EMP在大鼠肾移植术后引起的急性排斥反应模型和慢性环孢素肾病模型中的表达存在显著差异,大鼠肾移植术后AR模型与CCN模型相比,循环血中总CD144~+EMP中CD144~+perforin+EMP比率较高(P<0.05),CD144~+CD62E~+EMP的比率较低(P<0.05)。这种表型差异在肾移植术后引起的急性排斥反应和慢性环孢素肾病的鉴别中具有重要的参考价值。2.体外研究发现EMP可明显促进单核细胞分泌炎性因子TNF-α、趋化因子MCP-1,上调单核细胞表达HLA-DR,CCR2分子,揭示EMP可能通过促进单核巨噬细胞的浸润和活化参与慢性环孢素肾病的损伤机制。