背景与目的:卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖系统发病率居于第三位的恶性肿瘤,仅次于子宫颈癌和子宫体癌,但卵巢癌的病死率是所有妇科肿瘤中最高的。其临床症状不典型,发病部位隐蔽,易于转移及广泛播散。卵巢癌进行剖腹探查术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占30％,大多数己扩散到子宫双侧附件,大网膜及盆腔各器官,所以至今卵巢癌在诊断和治疗上仍是一大难题,而且治疗后极易复发。经以手术为主的综合治疗以后5年存活率仍然徘徊在30％左右。这一状况近十年来未能改善,对妇女生命造成严重威胁,因此探索新的治疗策略显得极为迫切。　　 近年来随着对肿瘤研究的不断深入,逐渐形成了肿瘤干细胞理论。人们发现肿瘤细胞中也存在等级现象,并且认识到仅少量肿瘤细胞在恶性肿瘤发展过程中起到干细胞作用,它们具有不断地自我更新和分化的能力,可以维持恶性肿瘤组织的不断生长和转移,还可以分化成各种肿瘤细胞和非肿瘤细胞。但是肿瘤组织中其余大部分细胞在经过短暂的分化后,即便没有化疗药物的作用也会最终走向凋亡或死亡。　　 目前对肿瘤干细胞的研究越来越多,并在多种实体肿瘤中证实了肿瘤干细胞的存在。卵巢癌干细胞的研究对认识卵巢癌的发病机制、早期诊断以及根治方法提示了新的研究方向。　　 分离和鉴定肿瘤干细胞是研究肿瘤干细胞的首要问题,但是如果缺乏特异的表面标记物,肿瘤干细胞的分离鉴定就变成一个难题。侧群细胞(Sidepopulation cell,SP cell,SP细胞)是利用DNA荧光染料Hoechst33342和流式细胞技术发现的特殊细胞亚群,能通过.ABC转运蛋白将荧光染料Hoechst33342泵出细胞而呈弱染状态,并因此而得名。侧群细胞可能是一种特殊类型的干细胞,具有自我更新、多向分化等一系列干细胞的生物学特征。至今人们已经在多种实体肿瘤中分离得到了侧群细胞。当缺乏干细胞特异标记的情况下,SP细胞分选和分析成为研究肿瘤干细胞的一种实用而重要的方法。　　 最近的研究发现,肿瘤干细胞的另一重要特征是它们具有间质细胞的特性,它们容易出现表皮细胞向间质细胞转化(Epithelial mesenchymal transformation,EMT)。EMT现象是肿瘤发生侵袭和转移的第一步,也是最重要的一步。阻断肿瘤干细胞的EMT特性,有可能预防肿瘤的侵袭和转移。　　 本研究利用SP细胞的弱染特性将OVCAR-3细胞系中的SP细胞分选出来,并对其生物学特性进行研究,为探索以肿瘤干细胞理论为基础的新的卵巢癌治疗策略提供实验依据。　　 方法:本研究中,首先用免疫细胞化学方法分析了干细胞相关基因Oct3／4在OVCAR-3细胞中的表达。随后将生长状态良好的OVCAR-3细胞经Hoechst33342染色后进行流式细胞仪分选,通过对Hoechst33342浓度和染色时间的调整对SP方法进行条件优化。对比维拉帕米抑制实验在流式细胞仪上设门,分别收集荧光阳性的NSP细胞和荧光阴性的SP细胞,研究它们生物学性状的差异,包括将分选后的两个亚群的细胞分别接种到六孔板中,进行克隆形成实验,比较两个亚群细胞克隆形成能力是否存在差异:分别提取两个亚群细胞的总RNA,进行real-time PCR,比较两个亚群细胞中干细胞相关基因Oct3／4和EMT相关基因Vimentin、E-cadherin、N-cadherin等的表达差异；用无血清培养基分别培养分选的SP细胞和NSP细胞,观察它们的形态变化；用不同剂量的X射线照射分选的SP细胞和NSP细胞,比较其对X射线的抵抗能力。　　 结果:免疫细胞化学结果显示,OVCAR-3细胞系中的一小群细胞表达Oct3／4蛋白,但与阳性对照精原细胞癌中Oct3／4蛋白的表达相比,OVCAR-3细胞中Oct3／4蛋白的表达非常微弱。　　 进行流式细胞分选时,当应用5μg／ml的Hoechst33342对卵巢癌细胞系OVCAR-3进行染色分析,结果重复数次均未发现SP细胞。当应用2.5μg／ml的Hoechst33342染色,37℃9阵育90min后上机分析,结果OVCAR-3细胞中出现了0.1％的SP细胞,且SP细胞经维拉帕米作用后数量减少或者消失。当应用1μg／ml的Hoechst33342染色,37℃孵育90min后上机分析,发现没有明显的SP细胞出现。　　 随后我们以不同的孵育时间与不同浓度的Hoechst33342相组合进行分析,最终发现,当应用2.5μg／ml的Hoechst33342染色染色60min,对照管中加入100μM的维拉帕米,37℃孵育60min后上机分析时,结合维拉帕米抑制试验,在OVCAR-3细胞系中设门,SP细胞最明显,比例为0.9％。随后SP细胞和NSP细胞被分选出来用于后续实验。　　 克隆形成实验显示,分选出的细胞培养12天之后,形成的大部分克隆的细胞数能达到50个以上,SP细胞的克隆形成能力远远高于NSP细胞,克隆形成率分别为(19.8±4.1)％和(3±1.3)％(P<0.01)。显微镜下见SP细胞有3种类型的克隆形成:Holoclones(形成克隆的细胞排列紧密,细胞直径较小,克隆直径最大)、Paraclone(形成克隆的细胞疏散分布,细胞直径较大,克隆直径较小)和Metoclone(介于Holoclone和Paraclone之间的克隆)。只有SP细胞能够形成Holoclones,NSP细胞仅能形成几个Paraclone和Metoclone。　　 无血清细胞培养实验显示分选的SP细胞和NSP细胞培养5天后,SP细胞表现出了明显的间质细胞特性,具体表现为细胞形态大部分明显拉长,呈明显的成纤维细胞形态,而NSP细胞的形态变化不明显。　　 Real-time RT-PCR研究发现,SP细胞与分选出的NSP细胞相比,Oct3／4表达更高(P<0.05)。并且与细胞形态变化相一致,SP细胞的N—cadherin和VemintinRNA的表达更高(P<0.05),而NSP细胞的E-cadherin RNA表达更高(P<0.05)。　　 X射线照射敏感性检测结果显示,SP细胞对X射线照射的抵抗能力明显强于NSP细胞。　　 结论:　　 1.人卵巢癌细胞系OVCAR-3中存在SP细胞亚群,SP分析的方法用来分析不同的细胞时条件需要进行优化。　　 2.人卵巢癌细胞系OVCAR-3中的SP细胞具有克隆形成率高、X线抵抗力强、高表达干细胞相关基因等肿瘤干细胞特性,OVCAR-3中的SP细胞可能富集了肿瘤干细胞。　　 3.人卵巢癌细胞系OVCAR-3中的SP细胞更容易发生EMT,可能在临床卵巢癌复发转移中起重要作用。