背景：　　钙网蛋白是一种广泛表达的内质网钙结合蛋白和分子伴侣。靶向敲除钙网蛋白基因会导致小鼠心室肌壁厚度的显著变薄，以及小鼠出现脐疝，上述缺陷可能是由于细胞外基质组成的改变引起的。钙离子作为一个广泛存在的信号分子，在细胞内起着非常重要的作用：影响各种生理病理过程，激活酶原以及各种激素第二信使的激活等等。　　细胞外基质是一种重要的组织结构，为组织细胞的生长，发展，形态发生提供一个支持环境。金属基质蛋白酶作为一个锌结合肽链内切酶超家族，可以降解细胞外基质，其活性可以从以下几方面调节：转录、分泌、酶原的激活，同时也在相应的特异性抑制剂下严格控制酶的活性。他们在很多生理病理过程中起着很重要的作用，可以导致一系列心血管疾病：血管重塑、动脉粥样斑块不稳定、心力衰竭、室壁瘤的发生、心肌梗死以及心肌梗死后左心室的重塑。　　JNK是MAPK家族中的一员，在炎症因子、环境压力、凋亡诱导剂的刺激下起着重要的作用。P53作为细胞转录因子，在各种细胞周期运行和诱导凋亡中起着重要作用。之前有研究表明靶向敲除钙网蛋白基因会明显影响p53的表达、功能、核定位能力，将导致钙网蛋白细胞（crt-/-）受紫外线刺激后p53介导的凋亡率下降。而本课题组前期研究则提示钙网蛋白缺失细胞，JNK信号通路受到影响：crt-/-细胞JNK2表达几乎检测不到。鉴于JNK和p53信号通路都是自然界中重要的调节通路，两者之间的关系随着细胞种类，外界环境等的变化而具有不同的相互调节方式。然而到目前为止，在小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblastcells，MEF)中JNK和p53的关系尚不明确。因此明确p53与JNK之间的关系有利于进一步为阐明心室重构的病理过程提供新的理论依据，并为临床疾病的治疗提供新方向。　　本课题组前期实验表明钙网蛋白基因敲除后，金属基质蛋白酶-2表达及活性升高，而金属基质蛋白酶-9表达及活性降低，这种活性改变可能参与了钙网蛋白敲除小鼠心脏的病理改变。其中JNK途径参与了其中的改变，然而，目前为止尚未见关于钙网蛋白是如何通过JNK途径调节金属基质蛋白酶的活性的研究，因此，本实验进一步探讨钙网蛋白通过哪些途径参与金属基质蛋白酶活性的调节。　　目的：　　体外培养小鼠胚胎成纤维细胞（Mouse embryonic fibroblastcells, MEF)野生株（widetype, wt）和钙网蛋白基因敲除株（calreticulinnull,crt?/?），探讨在两者蛋白水平表达差异，研究两者JNK和p53的关系，并初步探讨调节金属基质蛋白酶-9和-2活性可能的信号通路。　　方法：　　1. Western-blot检测钙网蛋白表达情况，验证细胞模型是否成立；利用双向电泳检测野生型和敲除型细胞蛋白表达差异点；　　2.体外培养wt和crt-/-小鼠胚胎成纤维细胞，提取总蛋白利用免疫沉淀-western immunoblotting-化学发光法检测两株细胞间JNK活性的差异；　　3. wt和crt-/-加入不同浓度的JNK特异性抑制剂SP600125处理24小时后检测p53的蛋白表达；同时wt和crt-/-加入不同浓度的p53抑制剂PFT-a处理24小时后检测JNK2蛋白表达情况；　　4. wt和crt-/-加入不同浓度的钙离子熬合剂EGTA和增加细胞外钙离子CaCl2后检测MAPK家族和p53变化情况；　　5. wt及crt-/-加入不同浓度钙离子熬合剂EGTA和人为增加细胞外钙离子CaCl2处理不同时间，明胶酶谱法检测MMP-9和MMP-2活性。wt及crt-/-加入不同浓度的JNK抑制剂SP600125(0，10，20 uM处理不同时间，明胶酶谱法检测MMP-9和MMP-2活性；并用不同浓度p53激动剂Nutlin-3(0，5，10，20 uM)作用wt细胞及crt-/-细胞不同时间，明胶酶谱法检测MMP-9和MMP-2活性。　　结果：　　1.钙网蛋白在野生型细胞中有表达，在基因敲除型细胞中几乎检测不到，双向电泳初步分离出部分蛋白表达差异点；　　2. EGTA熬合细胞外钙离子可以抑制ERK1/2，JNK和p53的蛋白表达；　　3. wt及 crt-/-加入不同浓度的JNK特异性抑制剂SP600125后，p53表达呈浓度依赖性降低；野生型和敲除型细胞加入不同浓度的p53抑制剂PFT-a后，JNK2表达呈浓度依赖性降低；　　4.与crt-/-相比，wt细胞JNK活性更高；　　5.熬合细胞外钙离子可以使crt-/-细胞MMP-9和MMP-2活性呈浓度依赖性升高，增加细胞外钙离子可以使crt-/-细胞MMP-9和MMP-2活性呈浓度依赖性降低，而wt细胞则没有明显改变；wt细胞和crt-/-细胞加入SP600125后MMP-9活性呈浓度依赖性和时间依赖性升高，MMP-2活性在wt细胞中呈浓度依赖性升高，但在10uM SP600125时则呈时间依赖性降低，MMP-2活性在 crt-/-细胞中呈浓度依赖性降低，在10uM SP600125时呈时间依赖性升高；crt-/-细胞经p53激动剂处理后，MMP-9和MMP-2活性呈浓度和时间依赖性升高。　　结论：　　1.靶向敲除钙网蛋白基因可以引起一系列蛋白表达发生差异；　　2. wt细胞和crt-/-细胞中JNK2和p53之间相互调节，存在一个正反馈环；　　3.相对于crt-/-细胞来说，wt细胞JNK活性更高；　　4.钙网蛋白可以通过calcium-JNK-p53通路参与调节MMP9/2活性。