几丁质是是虾蟹等甲壳动物的外壳、昆虫的外骨骼和许多真菌细胞壁的重要组成成分。许多微生物分泌各种酶来降解含几丁质生物质,为自身的代谢提供物质与能量,这些酶包括几丁质酶、乙酰葡萄糖胺糖苷酶、蛋白酶等,它们通过协同作用完成对几丁质的降解。人们已经详细研究了细菌和真核生物分泌的几丁质降解代谢途径,但到目前为止,已报道的具有几丁质降解能力的嗜盐古生菌仅有Haloferax mediterranei。极端嗜盐古生菌Natrinema sp. J7-2由本实验室从湖北应城盐矿分离得到,该菌株的基因组编码一个几丁质降解代谢相关的基因簇,其中包含一个蛋白酶基因sptC。与其他嗜盐胞外蛋白酶的C端延伸区所不同的是,SptC的C端延伸区由PkdD和ChBD这两个结构域组成。在本研究中,我们重点探讨了该酶自加工成熟机制及其在Natrinema sp. J7-2的几丁质分解代谢系统可能发挥的作用。首先,我们对Natrinema sp. J7-2基因组中几丁质分解代谢相关的基因簇及其编码的蛋白进行生物信息学分析。该几丁质分解代谢相关的基因簇在Natrinema属的成员中高度保守,它不仅编码几丁质酶(Chi1, Chi2and Chi3)、几丁质结合蛋白(Cbp)、糖类物质的ABC转运系统、胞内糖苷酶,还编码一个胞外蛋白酶SptC。Chi1、Chi2、Chi3、Cbp和SptC这五个蛋白前体均含有PkdD和ChBD这两个结构域,并且这两个结构域在氨基酸序列上呈现出相似性,表明这几个蛋白质在进化和功能方面具有相关性。同时,我们通过实验证明菌株J7-2具备降解几丁质的能力并能利用其降解产物作为唯一碳源进行生长。其次,我们对重组SptC体外活化过程进行了研究,并通过构建一系列缺失突变体,探讨N端前肽、PkdD和ChBD在蛋白酶活化、活性和稳定性方面的功能。重组SptC (SptC*)在高盐条件下的活化过程经历两步加工：首先SptC通过顺式加工对N端前肽核心区域(N*)进行切割,形成自加工复合物N*-IwT；随后,自加工复合物中的N*和连接肽通过反式加工被降解,并伴随着ChBD的切除,N*-IWT转变为由催化功能域和PkdD组成的成熟酶。在SptC自加工成熟过程中,N端前肽作为分子内伴侣帮助前体正确折叠,N端前肽缺失突变体SptCAN无法正确折叠。C端延伸区对于SptC的折叠和自加工并不是必需的,但是缺失C端延伸区会导致SptC成熟速度减慢。SptC及各突变体成熟酶的最适盐浓度为3-3.5M NaCl,它们需要高盐条件以维持自身稳定性。PkdD的存在提高了SptC成熟酶的活性但对稳定性没有影响。然后,我们对SptC与几丁质相关功能进行研究。ChBD介导SptC与几丁质结合,而且ChBD对几丁质的结合能力随着盐浓度的上升而增强。SptC无法与纤维素或壳聚糖结合。同时,几丁质和纤维素可以加快SptC及各C端缺失突变体的成熟速度,而含有ChBD的自加工复合物(N*-I1WT和N*-IΔPkdD)可以通过ChBD与几丁质结合,增加与几丁质相互作用的机会并提高几丁质周围自加工复合物的局部浓度,从而使几丁质对SptC*和SptCAPkdD的成熟促进效果更为显著。此外,我们选取了与SptC同源但不含ChBD的SptA、pyrolysin、S41、sphericase和WF146蛋白酶,对多糖促进蛋白酶成熟的作用进行了进一步探讨。结果显示,多糖虽然均无法与这五种蛋白酶结合,但几丁质和纤维素能在一定程度上加快WF146蛋白酶的成熟速度,并且与它们对SptCΔCTE和SptCΔChBD的成熟促进效果相似。这些结果表明,这些多糖对蛋白酶成熟的促进作用并不完全依赖于ChBD的存在,而可能与蛋白酶的氨基酸序列特异性有关。最后,我们发现SptC可以在高盐浓度下降解虾壳粉中的蛋白质组分。虾壳粉被自加工复合物N*-IWT处理后可溶肽段的释放的速度比被成熟酶MWT处理过的样品要快。究其原因,可能是N*-IWT通过ChBD与虾壳粉中几丁质结合不仅加快N*-IWT的活化,还增加了虾壳粉周围的成熟酶浓度,从而加快了蛋白酶对虾壳蛋白质的降解。这些结果表明,蛋白酶SptC可能参与嗜盐古生菌Natrinema sp. J7-2对含几丁质生物质的降解。