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随着快节奏的生活和工作,处于高压状态的人群倍感疲劳,表现为脑力体力不支、工作效率下降以及精神和认知的功能失调,严重影响身体健康。近年来已有许多文献报道,氧化损伤是引起疲劳的重要因素。高F值肽因其独特的结构特点、理化性质和生物功能成为近几年研究的重要课题。本文以红松(Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.)松仁为原料,优化高F值肽的酶解工艺,通过超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析对目标活性肽进行分离纯化,利用凝胶渗透色谱(GPC)、氨基酸自动分析仪对目标活性肽初步探讨分子量分布和氨基酸组成,采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)结合氨基酸分析鉴定其氨基酸序列,建立动物模型分析体内抗疲劳和抗氧化作用。确定了红松松仁高F值肽的最优酶解工艺条件。采用胃蛋白酶和胰蛋白酶制备红松松仁高F值肽,主要优化胰蛋白酶的酶解工艺条件,以水解度和OD220/OD280为指标,在单因素实验的基础上进行响应面分析,得到优化胰蛋白酶的最佳酶解工艺条件为:p H为7.98,水解温度为44.68℃,加酶量为5886.11 U/g,酶解时间为90 min,底物浓度为6%。经氨基酸自动分析仪测定松仁高F值肽中F值为20.75(F>20),符合高F值的要求。进行了红松松仁高F值肽的分离纯化。红松松仁高F值肽粗品经过超滤、离子交换层析和凝胶过滤层析三次分离,得到了抗氧化活性最强的组分PPH1-D-Ⅱ。采用GPC进行分子量分布的测定,结果表明PPH1-D-Ⅱ分子量主要集中在500~1500 Da,通过氨基酸自动分析仪对PPH1-D-Ⅱ组分中的氨基酸组成与含量进行了测定,结果发现PPH1-D-Ⅱ的F值为29.58。采用MALDI-TOF-MS结合氨基酸分析鉴定出两种肽段,其序列结构分别为Asn-Gln-Lys-Pro-Asp-Phe-Glu-Asn-Asp-Asn-Gly-Arg-Phe和Arg-Gly-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ala-Glu-Glu-Arg,分子量分别为1580.745 Da和1362.598 Da。对PPH1-D-Ⅱ的抗疲劳抗氧化作用进行评价。结果表明:PPH1-D-Ⅱ不影响小鼠体重的变化和正常的生长,还能增加小鼠脏器指数,显著延长小鼠负重游泳的时间,增加小鼠体内血糖和肝糖原的水平,提高抗氧化酶系SOD、CAT和GSH-PX的活力,降低乳酸、血清尿素氮和丙二醛的含量,结果表明,PPH1-D-Ⅱ具有一定的抗疲劳功效,且PPH1-D-Ⅱ各剂量中SOD的活力与肝糖原、血清尿素氮、乳酸之间的相关系数分别为0.8688、0.9838、0.9312,各剂量中GSH-PX的活力与肝糖原、血清尿素氮、乳酸之间的相关系数分别为0.9216、0.9547、0.9685,表明PPH1-D-Ⅱ既具有体内抗疲劳作用,又存在抗氧化活性,两者存在良好的相关性。疲劳的存在以及氧化应激会造成机体抗氧化防御系统和免疫系统失衡,因此,本课题的研究进一步表明了PPH1-D-Ⅱ对机体疲劳损伤系统的防护作用。研究发现PPH1-D-Ⅱ能提高小鼠的免疫能力,降低机体在疲劳状态下的能量消耗和有害物质的积累,提高机体抗氧化酶系活力,减少自由基的大量产生。本研究对于解释抗疲劳与抗氧化的相关性提供了理论支持,对进一步开发天然产物作为抗疲劳抗氧化产品具有应用价值及指导意义。