研究目的纳米银(Silver Nanoparticles,AgNPs)材料因其良好的抗菌性能及独特的理化性质,在创/烧伤医学上有着广泛的应用前景。但因其较明显的细胞毒性及尚不明确的毒理机制,较大程度的限制了AgNPs材料的广泛推广。本研究拟通过自主合成AgNPs材料,明确其体内外细胞毒性作用、观察其进入细胞后银离子的代谢、重金属毒性作用以及其对细胞溶酶体膜通透性的作用,探索AgNPs材料可能的细胞毒理机制。研究方法1.合成及鉴定AgNPs材料:以PVP为稳定剂,乙醇还原法合成AgNPs材料,用Uv-Vis、TEM、DLS对AgNPs材料进行鉴定,观察其粒径及均匀度,透析法检测AgNPs的溶液稳定性。2.AgNPs材料体外及体内细胞毒性测定:CCK 8法检测AgNPs材料对人皮肤成纤维细胞的毒性作用;AgNPs材料在小鼠皮下局部应用后观察其在体分布及主要脏器功能损伤情况。3.AgNPs材料释放Ag~+所致细胞重金属毒性作用:Lyso-tracker Red探针标记溶酶体,观察AgNPs材料进入细胞后的分布情况;ICP-MS检测AgNPs在细胞内的代谢情况,Western Blot检测不同时间点细胞内金属硫蛋白的含量,流式细胞技术检测不同时间点细胞坏死及凋亡情况,并以2,3-二巯基丙醇为螯合剂清除Ag~+的影响后评估AgNPs材料的重金属毒性在细胞凋亡中所起的作用。4.AgNPs材料致溶酶体膜透化作用诱导细胞凋亡:通过测定AgNPs入胞后胞质内组织蛋白酶B活性,评估AgNPs致溶酶体膜破坏程度;抑制溶酶体膜透化和/或联合Ag~+螯合剂后,观察CB活性及金属硫蛋白含量,以期阐明溶酶体膜通透化与重金属毒性作用之间的关系。研究结果1.乙醇还原法合成的AgNPs材料粒径为22.69±4.15nm,粒径分布均匀,在DMEM中稳定存在,48小时Ag~+释放率为1.46±0.03%。2.AgNPs与Ag~+相比其成纤维细胞毒性明显降低(24μg/ml vs 3μg/ml);AgNPs的细胞毒性呈剂量与时间依赖效应关系;单剂AgNPs 48μg/g.bw小鼠背部皮下局部应用后AgNPs主要分布于肝脾中、于24小时达高峰,48小时后可检测到肝功能损伤。3.AgNPs进入溶酶体后可释放大量的Ag~+进入胞质并致细胞重金属毒性作用,主要通过产生活性氧诱导细胞凋亡(48小时凋亡率为49.7±3.57%);而由AgNPs直接导致的细胞坏死率小于0.5%;采用螯合剂清除Ag~+后48小时的细胞凋亡率仅部分降低(48小时凋亡率降为26.7±3.06%),结果提示Ag~+的重金属毒性不是AgNPs的唯一的毒理机制。4.AgNPs致胞质内组织蛋白酶B活性上升提示溶酶体膜通透性改变,此外细胞凋亡率同步升高;采用保护溶酶体膜或抑制溶酶体酶活性均可部分降低细胞的凋亡率、但金属硫蛋白含量无改变;采用螯合剂清除Ag~+后不能明显降低细胞内的组织蛋白酶B活性;通过联合使用Ag~+螯合剂及溶酶体膜通透性抑制剂可同时降低细胞内金属硫蛋白的表达及细胞内组织蛋白酶B的活性,且几乎全部抑制由AgNPs引起的细胞凋亡的发生。研究结论1.与Ag~+直接损伤细胞膜所致人成纤维细胞坏死相比,AgNPs材料该作用已显著降低(细胞坏死率<0.5%),但AgNPs仍具有致成纤维细胞凋亡的作用。2.在体皮下局部应用AgNPs材料(48μg/g.bw)可致肝细胞及肝功能损害。3.AgNPs主要通过胞吞方式进入细胞溶酶体,溶酶体内的AgNPs释放Ag~+到胞质中,通过其重金属毒性作用可致细胞凋亡,为AgNPs毒性作用机制之一。4.AgNPs进入溶酶体后还可破坏溶酶体膜稳定性致膜通透性增加,释放组织蛋白酶进入胞质,诱导细胞凋亡发生,此为AgNPs独立于其重金属毒性毒理机制之外的作用机制。5.通过联合螯合Ag~+和抑制溶酶体膜通透化可有效抑制AgNPs引起的成纤维细胞的凋亡,并有效降低AgNPs体内外细胞毒性作用。