目的:益母草为唇形科植物益母草Leonurus japonicas Houtt.的新鲜或干燥地上部分,全国大部分地区均产,多为栽培。益母草具有活血祛瘀,养血调经,消肿解毒等功效,是中医妇科常用药,有“血家圣药”、“经产良药”之称。文献研究可知,益母草中含有生物碱、黄酮、二萜、苷类、脂肪酸、挥发油、环型多肽等多类化学成分。目前关于益母草质量控制的研究大多集中在其制剂方面,如注射剂、颗粒剂、流浸膏、胶囊等。现行的益母草质量标准多用生物碱类成分作为药材的指标性成分,主要对盐酸水苏碱和盐酸益母草碱进行含量测定,对其他化学成分的关注度不高。但中药材的药效不是来自任何单一的活性成分[1],而是通过对人体多途径、多靶点的整体作用与人体相互作用,各种有效成分的综合结果。用代表中药物质基础的化合物群所表征的指纹图谱来综合评价益母草药材的质量,能够更好适应中药模糊性和整体性的特征,更加全面、科学的控制其质量。现代药理研究表明,益母草具有溶栓、抗凝、降脂、降血黏度、降低红细胞聚集、抑制血小板聚集、改善微循环、抗氧自由基和减少细胞内钙超载等诸多药理作用[2,3],临床上常用于治疗月经不调、高黏血症、心肌缺血、冠心病、急性肾炎浮肿等血栓性疾病,及高血压、高血糖等由血栓性疾病引起的代谢类疾病。已有实验证明,用盐酸肾上腺素诱导的斑马鱼血栓模型稳定、可靠,可作为抗血栓药物的筛选模型。通过斑马鱼血栓模型,完成对益母草不同提取部位抗血栓活性的筛选,建立益母草抗血栓活性部位指纹图谱,将有助于进一步完善益母草的质量控制标准。方法:(1)采用HPLC法与相似度评价、聚类分析、主成分分析相结合的方法,建立益母草药材HPLC指纹图谱。(2)采用HPLC法同时测定益母草中益母草碱、芦丁的含量,为益母草药材质量标准改进提供参考。利用近红外光谱法建立益母草碱定量分析模型,为高通量的测定、鉴别益母草药材提供参考。(3)利用盐酸肾上腺素诱导的斑马鱼血栓模型,对益母草不同提取部位的抗血栓活性进行初步研究。(4)采用HPLC法与相似度评价、聚类分析、主成分分析相结合的方法,建立益母草抗血栓活性部位HPLC指纹图谱。结果:(1)建立了益母草药材的HPLC指纹图谱,确定了 15个共有峰,运用相似度评价、聚类分析、主成分分析对27批益母草药材质量评价,三种分析方法所得结果一致,三者相互验证,增加了结果的可信度。分析结果显示,27个产地的益母草被分为4类:四川冕宁3批聚为一类;四川会理2批和湖南桂东聚为一类;浙江3批、河南2批和山东、广东产样品聚为一类;安徽毫州、河北安国、北京同仁堂、浙江三门产样品聚为一类。总体看来,四川冕宁益母草基地栽培样品与市面流通的药材质量差异较明显,提示栽培方式可对益母草质量产生较大影响。浙江三门并未与其他浙江产地归为一类,四川冕宁与会理也分别归类,提示同一省所产的益母草药材,质量也不尽相同。浙江、河南、山东、广东四处产地聚为一类与其他区别,提示采收时间可对益母草质量产生较大影响。安徽亳州、河北安国和北京同仁堂三处药材市场的益母草质量整体接近,提示现在药材市场中益母草质量大体相近。(2)建立了有效成分益母草碱、芦丁的HPLC含量测定方法,测定了 27个不同产地的益母草药材中两种有效成分的含量。实验发现,北方产地的益母草碱含量明显较高于南方产地,浙江产地的益母草碱含量相对其他产地较低;四川冕宁益母草基地产的益母草,所含芦丁含量相较于其他产地明显较高;综合看来北京同仁堂和四川冕宁的相较其他产地益母草碱和芦丁含量更高。建立了益母草碱的近红外定量校正模型,与HPLC法所测定的结果进行对比分析,结果表明样品益母草碱含量预测值能较好地符合实际值。提示该近红外光谱法所建立的定量分析模型能够较为快速、准确测定不同产地益母草中益母草碱含量。(3)验证了盐酸肾上腺素(AH)诱导的斑马鱼血栓模型,并运用该模型对益母草不同提取部位的抗血栓活性进行初步研究。结果表明,经AH诱导,斑马鱼幼鱼尾静脉处形成明显血栓,且血栓面积显著大于空白组,实验显示该模型稳定,可用于抗血栓活性筛选的实验。益母草不同提取部位的低、中、高剂量治疗组均有明显的抗血栓作用,其中水部位、乙酸乙酯部位、70%乙醇提取液作用显著。(4)建立了益母草抗血栓活性部位中,乙酸乙酯部位HPLC指纹图谱,确定了15个共有峰,运用相似度评价、聚类分析、主成分分析对27批益母草药材质量评价,三种分析方法所得结果一致,三者相互验证,增加了结果的可信度。分析结果显示,样品经乙酸乙酯萃取后,仍保留了益母草大体信息,萃取聚类结果与样品聚类结果有细微不同,提示是萃取富集了部分有效成分的原因。27个产地的益母草乙酸乙酯部位被分为3类:河南、湖南、广东、浙江产益母草,与河北、北京、山东产益母草,在乙酸乙酯部位分为两大类;提示益母草药材乙酸乙酯部位可按照秦岭淮河一线,区分为两大类,西南地区产区别于这两类。结论:本实验建立了益母草HPLC指纹图谱结合活性成分含量测定的方法,旨在为完善益母草的质量标准提供参考;建立了益母草碱的近红外定量校正模型,该模型能够较为快速、准确测定益母草碱的含量;验证了盐酸肾上腺素诱导的斑马鱼血栓模型。实验研究表明益母草不同提取部位对盐酸肾上腺素诱导的斑马鱼模型均有明显的抗血栓作用,其中水部位、乙酸乙酯部位、70%乙醇提取液作用显著。建立了益母草抗血栓活性部位中,益母草乙酸乙酯部位的HPLC指纹图谱,以期为益母草的全面、有效的质量控制评价方法提供参考。