白血病是造血系统的恶性疾病,是国内十大高发恶性肿瘤之一。目前,化疗和骨髓移植仍是白血病治疗的常用手段,但往往存在耐药、复发率高、治疗期内因感染引起早期死亡等缺点。因此,探索白血病临床治疗的新方法和技术手段是当前生物医学的研究热点和亟待解决的重大问题。声动力疗法(Sonodynamic therapy,SDT)是利用超声激活在肿瘤组织/细胞内特异性富集并长时间潴留的卟啉类及其衍生物等声敏剂而产生协同效应来杀伤肿瘤细胞。SDT疗法具有靶向性好、对正常组织毒副作用小等优点,在肿瘤治疗中具有独特的优势和潜在的应用价值。作为第二代光敏剂,二氢卟吩e6(Chlorine6,Ce6)在肿瘤细胞中具有较好的选择性并能长时间潴留。已有研究证明二氢卟吩e6在光动力疗法有一定的抗肿瘤效应,在超声的作用下,二氢卟吩e6也能表现出良好的SDT抗肿瘤效应。本研究是在前期工作的基础上,以国家自然科学基金项目为依托,选择人白血病K562和U973细胞为细胞模型,Ce6为声敏剂,研究超声结合Ce6杀伤白血病细胞死亡模式及其分子机制,为声动力诱导白血病细胞死亡的细胞生物学机制研究和临床应用提供了下述有价值的科学依据。1.Ce6在白血病K562和U973细胞中的定量定位研究:实验通过流式细胞仪检测了 Ce6在K562和U973细胞中代谢规律,结果表明,随着Ce6浓度的增加,细胞对其吸收量相应增加;同一药物浓度下,在加药后6h内,随着孵育时间的延长,Ce6进入细胞中的含量也逐渐增多,当孵育时间超过6 h,各浓度组细胞内的Ce6含量基本不再增加,进入平台期,维持在一个相对稳定的状态。实验采用激光共聚焦显微镜结合细胞器特异性荧光探针研究了 Ce6在细胞内的亚细胞定位,结果表明,Ce6在K562和U973细胞内主要定位于线粒体。2.超声结合Ce6杀伤K562和U937细胞的参数筛选:实验分别研究了 Ce6浓度、超声处理强度对离体培养的K562和U937细胞的杀伤作用。结果表明,细胞的相对存活率随着Ce6浓度的增大而下降,20 μg/ml和10 μg/ml Ce6分别是K562细胞和U937细胞的损伤阈值。超声强度对K562和U937细胞的相对存活率有一定的强度依赖性,超声强度越强,其对细胞的损伤越明显,2W/cm2的超声强度是K562和U937细胞的损伤阈值。超声结合Ce6对K562和U937细胞的增殖抑制作用在SDT处理后4-24 h的趋势表现一致,均显示出明显的协同杀伤作用。3.Ce6介导的SDT对K562细胞的损伤作用研究:实验主要研究了 2W/cm2的超声结合20μg/ml的二氢卟吩e6联合处理后,K562细胞不同死亡模式及相关机制分析。①通过扫描电镜和透射电镜观察证实SDT处理后K562细胞的超微结构发生明显变化。②通过流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、Western blot技术检测了 SDT处理后K562细胞凋亡的情况,结果表明:流式细胞仪结合Annexin V-PE/7-AAD实验提示SDT处理可以引起K562细胞发生凋亡;Rho123染色显示SDT处理后0.5 h,K562细胞的线粒体膜电位显著下降,随孵育时间的延迟,膜电位逐渐恢复;荧光显微镜结合DAPI染色显示SDT处理后细胞核出现明显的凋亡核特征;激光共聚焦显微镜观察发现SDT处理后0.5 h-2h,Bax由胞浆转定位到线粒体;Western blot检测SDT处理后凋亡相关蛋白的表达变化显示Caspase-8,Caspase-9,Caspase-3被水解活化,PARP出现明显的89KDa的剪切片段,提示SDT处理可能触发了 K562细胞Caspase依赖性凋亡发生。③通过Western blot、透射电镜、基因转染及激光共聚焦显微镜检测了 SDT处理后K562细胞自噬的发生,结果表明:SDT处理后0.5 h时,自噬相关蛋白LC3由Ⅰ型向Ⅱ型转换现象最为明显;透射电镜观察到SDT处理组细胞内有自噬泡存在;SDT处理后,eGFP-LC3转染的K562细胞中出现更多的绿色荧光聚集或缺失区域,提示LC3蛋白发生重分布参与自噬,且SDT诱导的K562细胞自噬与线粒体相关。④通过Western blot研究.SDT处理对MAPK通路相关蛋白表达变化的影响,结果表明:SDT处理后0.5h,K562细胞中p38MAPK蛋白的磷酸化水平明显增加,然后在2 h内迅速恢复到正常水平。而p38 MAPK蛋白表达水平在SDT处理前后几乎无任何明显变化。另外,SDT作用后0.5 h,JNK信号通路迅速活化,JNK的磷酸化水平明显增高,且其上游活化因子MKK4,下游作用底物c-Jun、ATF-2的磷酸化水平均明显增强。在ERK信号通路中,处于MAPKK位置的MEK1/2的磷酸化水平在处理后0.5 h到2 h之间维持稍高水平,在SDT处理4 h之后逐渐恢复到与对照组相当的水平,而MEK1/2本身的蛋白表达水平在SDT处理后不同时间点基本维持不变;处于MAPK位置的ERK1/2的磷酸化水平在SDT处理后不同时间点稍有增强,并且ERK蛋白在SDT处理后4 h明显下降,提示SDT可能通过抑制ERK途径来抑制K562细胞增殖。4.Ce6介导的SDT对U937细胞的损伤作用研究:实验主要研究了 2W/cm2的超声结合10 μg/ml的二氢卟吩e6处理后U937细胞凋亡及相关机制分析。①通过扫描电镜和透射电镜观察证实SDT处理后U937细胞的超微结构发生明显的变化。②通过流式细胞仪、激光共聚焦显微镜、Western blot检测了 SDT处理后U937细胞凋亡的情况,结果表明:SDT处理后,ViaCount检测U937细胞存活率仅为50.1%;Annexin V-PE/7-AAD检测显示SDT处理后,U937细胞凋亡率为41.3%;罗丹明123检测线粒体膜电位显示,SDT处理后0.5 h,U937细胞线粒体跨膜电位明显下降,1 h时,膜电位下降最为显著,之后逐渐恢复;DAPI染色显示SDT处理后U937细胞核发生明显变化;Western blot检测SDT处理后凋亡相关蛋白PARP的表达变化显示,SDT处理后2h,PARP出现明显的剪切片段,且此现象一直持续到处理后24 h。③通过Western blot研究SDT处理对MAPK通路相关蛋白表达变化的影响,结果表明:p38 MAPK的磷酸化水平于SDT后0.5h便开始升高,2 h达高峰,8h内维持较高水平,随后逐渐下降;JNK磷酸化水平于SDT处理后0.5 h开始升高,之后便逐渐下降,于SDT后24 h恢复到与对照组相当的水平;JNK的上游活化因子MKK4及其下游作用底物c-Jun、ATF-2的磷酸化水平在SDT处理后0.5 h均有不同程度的增强;在SDT处理后0.5h,ERK1/2的磷酸化水平明显升高,之后迅速下降,并且ERK1的磷酸化水平高于ERK2;SDT处理对总ERK1/2表达水平基本无影响,而ERK上游激酶MEK在SDT处理后0.5-2 h之间磷酸化水平相对对照组也有升高,4 h后降低至与对照组相当的水平,而MEK总体表达水平在声动力处理后维持不变。④MAPK不同信号转导途径中特异性抑制剂对声动力处理U937细胞存活率的影响结果表明:P38MAPK信号通路抑制剂SB203580能引起Ce6-SDT诱导的U937细胞存活率的升高;JNK信号转导通路抑制剂SP600125能降低SDT诱导的U937细胞毒效应;ERK上游激酶MEK1/2的抑制剂PD98059对Ce6-SDT诱导U937细胞存活率的变化影响不明显,稍微增强了声动力的细胞毒效应;ERK磷酸化抑制剂U0126增强了 Ce6-SDT诱导的U937细胞存活率下降。⑤发现U0126增强SDT诱导U937细胞毒效应可能与其增强了 SDT组细胞内ROS产生和线粒体损伤相关。