论文部分内容阅读
紫心甘薯(purple-fleshed sweet potato)是栽培甘薯[Ipomoea batatas(L.)Lam.]中一个具有独特遗传性状和经济价值的特色品种类型,因其块根富含花青素(cyanidin),块肉呈深紫色而得名。近年来,紫心甘薯因其花青素含量高而作为一种极具开发价值的“天然色素”和“保健品”的优质原料作物而引起广泛的关注。植物花色素苷的生物合成是由一系列的酶催化完成的,其中,类黄酮3-O-糖基转移酶(UF3GT)是花色素苷合成的最后一个酶,UF3GT起到糖基转移的作用,使花色苷稳定性和水溶性提高,同时促进了花色苷的大量积累,使花色素由无色转为有色。本论文针对紫心甘薯在理论研究中试材的独特性和应用上的巨大潜力,以紫心甘薯为试材,以花青素合成代谢途径中的合成酶基因UF3GT为研究对象,对它的结构、进化、表达特征和功能进行了研究,为开展紫心甘薯花青素合成的分子机理及分子育种研究奠定基础。
本论文获得了以下主要的研究结果:
1、从紫心甘薯“山川紫”的块根中克隆获得了UF3GT基因的全长cDNA和DNA序列,将其命名为.IbUF3GT基因(GeneBank登录号:GU989254)。IbUF3GT基因的cDNA序列的全长为1294bp,开放阅读框(ORF)的长度为1110bp,编码369个氨基酸。IbUF3GT基因的cDNA序列还包括了55bp的5’-UTR和129 bp的3’-UTR。预测IbUF3GT蛋白的分子量为39.9 kDa,等电点为5.85。SOPMA预测结果表明,IbUF3GT蛋白由44.17％的α-螺旋(α-helix)、13.01％的延伸片(extended strands)、6.50％的β-转角(β-turn)以及36.31％的无规则卷曲(random coil)所组成。
2、IbUF3GT基因与其它植物已知的UF3GT基因序列具有很高的同源性和共同的进化起源。构建IbUF3GT的系统进化树,分析表明它属于糖基转移酶家族的成员,与旋花科的几种植物同属一分支。
3、在不同的甘薯品种或品系(A5、山川紫和禺北白)的基因组中,IbUF3GT都没有内含子,因此可以推测不同的甘薯品种或品系IbUF3GT基因在内含子插入上无差异。
4、用半定量的方法(RT-PCR)考察了IbUF3GT基因在紫心甘薯品种“山川紫”的不同组织部位以及不同紫心甘薯品种或品系块根中的表达情况。结果表明,在紫心甘薯品种“山川紫”各组织器官中均检测到IbUF3GT的表达,且在块根中表达量最大；不同品种或品系甘薯块根中IbUF3GT基因的表达水平与其花青素含量呈一致性趋势。将获得的 IbUF3GT基因连接到pPROEX-Hta表达载体,IPTG诱导其表达,获得了重组蛋白 UF3GT,重组蛋白的大小与预期的大小一致,证明克隆到的UF3GT基因序列是可以被表达的。
5、构建了IbUF3GT基因的真核超表达载体,将.IbUF3GT基因转化到相应的拟南芥缺失突变体中,经过转化并鉴定为阳性的拟南芥转基因植株的叶子和茎的颜色变紫,其花青素含量比突变体本身有了显著的提高,从而证明获得的IbUF3GT基因能编码相应的蛋白酶,为具有功能的基因序列。
6、构建了IbUF3GT基因带荧光标记的表达载体,将其转化进洋葱表皮细胞,亚细胞定位分析表明 IbUF3GT表达产物定位在细胞质中。