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前言P21活化激酶(P21-activated kinase,PAK)是一类进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,为Rho家族小鸟苷三磷酸酶(Rho-GTPase)Cdc42/Rac下游靶蛋白,参与许多重要细胞活动。到目前为止PAK家族共有6个成员,皆含有氨基末端(N-末端)调节区和羧基末端(C-末端)激酶区。根据其结构相似性,将它们分为两类,Ⅰ类包括PAK1,PAK2和PAK3,Ⅱ类包括PAK4,PAK5和PAK6。两类PAK在结构、活化方式、生物学功能上有着很大的区别,它们具有不同的下游靶蛋白。PAK4是Ⅱ类PAKs中首先发现的成员,对其功能的研究比较深入。随着PAK4下游蛋白的不断发现,已明确其在许多生物学活动如细胞骨架重排、细胞迁移、细胞凋亡中发挥重要作用。最新研究发现,PAK4还参与神经系统的发育过程,尤其参与一些神经系统疾病(如帕金森病)的病理过程。P65是本实验室利用酵母双杂交技术从人胎脑cDNA文库中筛选出的PAK4新的相互作用蛋白。P65是一种神经特异性蛋白,可与突触膜蛋白Syntaxin直接结合,并形成复合物,通过调节突触小泡与突触前膜的锚定、融合过程,实现其对神经递质释放的调节。虽然P65是神经细胞胞吐过程中重要的蛋白,同时其相互作用蛋白可能在融合过程中起至关重要的作用,但仅少数几个P65结合蛋白被发现。本课题旨在证实PAK4与P65的相互作用关系,进而初步探讨其生物学功能。实验材料与方法一、实验材料1、基因克隆相关分子生物学试剂。2、酵母双杂交和酵母质粒提取相关试剂。3、体外转录试剂盒。二、实验方法1、顺序转染法筛选PAK4相互作用蛋白P65。2、在AH109酵母菌中验证PAK4与P65相互作用。3、在大肠菌BL21中诱导P65蛋白的表达并纯化。4、利用GST-pull down实验体外验证PAK4与P65相互作用。结果酵母双杂交实验筛选出PAK4新的相互作用蛋白P65,测序结果表明PAK4可能与P65的C-末端相互作用。将其共转到AH109酵母菌中,进行酵母体内验证,结果显示两者能够相互作用,同时表明P65可能与PAK4的结合域与激酶域都相互作用。GST-pull down实验结果进一步证实了两者在体外的相互作用。结论1、P65是PAK4新的相互作用蛋白。2、PAK4可能与P65的C-末端相互作用。3、P65可能与PAK4的结合域与激酶域都相互作用。