日本沼虾（Macrobrachiumnipponense）又称河虾、青虾，主要生活在江河、湖泊及池塘等淡水水域中，是我国重要的淡水养殖品种。随着养殖面积的扩大化，环境污染和病害问题日益增多，导致青虾病害蔓延扩大。嗜水气单胞菌是淡水养殖水体中的一种条件致病菌，当环境恶化，养殖动物免疫机能下降，可能会导致疾病的暴发。咪唑类物质KK-42最初作为一种昆虫生长调节剂，对某些经济类甲壳动物也具有促生长效应。我们首次发现，KK-42能提高日本沼虾感染嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)后的成活率，但作用机理尚不清楚。日本沼虾等甲壳动物缺乏真正的抗体，主要靠非特异性免疫机制实现其免疫，众多的免疫因子参与了此过程。我们首先克隆了一些重要的免疫相关因子，如过氧化物超歧化酶(SOD)、血蓝蛋白和酚氧化酶原等基因，并分析了KK-42对其基因及相应蛋白表达的影响，为阐明KK-42提高日本沼虾成活率的机制提供资料。　　 将体长4.5±0.5cm的日本沼虾随机分成2组:实验组和对照组，其中，实验组用1.95×10-4mol/L的KK-42溶液浸泡处理1min，对照组用不含KK-42溶液做相同的处理;12h后，实验组和对照组各分为两个亚组，分别从沼虾腹部血窦注射嗜水气单胞菌（菌液感染组）或等量生理盐水（生理盐水组），观察48h内日本沼虾的死亡数量，计算成活率;另外，于KK-42处理后不同时间分别抽取血淋巴、解剖肝胰腺等组织，用Real-timePCR方法测定SOD、血蓝蛋白及酚氧化酶原mRNA的表达水平，分光光度法测定相应的酶活性。结果如下:　　 实验期间，生理盐水对照组和生理盐水实验组成活率均在90％以上。注射嗜水气单胞菌后，对照组成活率迅速下降，在24h成活率最低并趋向稳定;KK-42预处理组成活率在6、12、24h内比对照组增高了25％、141％和133％，呈显著或极显著差异(P＜0.05，P＜0.01)。KK-42预处理能明显提高细菌的清除能力，注射嗜水气单孢菌3h和6h后，相对于对照组，KK-42处理组细菌的清除率分别提高19.O％和85.5％。　　 首次从肝胰腺中克隆了细胞质MnSOD（cytMnSOD）和线粒体MnSOD（mtMnSOD）基因cDNA全长序列。cytMnSOD基因cDNA全长1233bp，开放阅读框为858bp，编码663个氨基酸，N端含有60个氨基酸残基组成的延伸区;mtMnSOD基因cDNA全长1113bp，开放阅读框为654bp，编码218个氨基酸，N端含有20个氨基酸残基组成的信号肽:cytMnSOD和mtMnSOD预测蛋白分子量及等电点分别为76.65KDa、31.33kDa和5.62、7.12。cytMnSOD推导的氨基酸序列与mtMnSOD的相似性为40％，二者均含有MnSOD的特征肽段(DVWEHAYY)、4个Mn2+结合位点和2个N-糖基化位点。Real-timePCR结果表明，cytMnSOD和mtMnSOD在肝胰腺、肌肉、血细胞、大颚器官、卵巢和鳃等组织均有表达，其中肝胰腺表达量最高;肝胰腺cytMnSOD和mtMnSOD基因的表达量在蜕皮间期最高，蜕皮后期和蜕皮前期较低。KK-42处理可显著诱导肝胰腺Mn.SODmRNA的表达以及肝胰腺中SOD酶活性，提示KK-42处理有利于提高动物对不良环境的适应，增强了自身的免疫能力。　　 首次从肝胰腺中克隆出血蓝蛋白基因cDNA全长序列，其全长2151bp，包含145bp的5UTR、14bp的3UTR和1991bp的开放阅读框(ORF)。ORF编码663个氨基酸，预测分子量为76.65KDa，理论等电点为5.42，含有典型的三个血蓝蛋白结构域和两个保守的铜离子结合位点。与淡水螯虾、凡纳滨对虾血蓝蛋白相似性分别为70％和63％。该基因在肝胰腺中的相对表达量最高，肌肉和血细胞表达较弱，大颚器官、表皮和卵巢几乎不表达;肝胰腺血蓝蛋白基因的表达量在蜕皮间期最高，蜕皮后期和蜕皮前期较低;嗜水气单胞菌刺激后肝胰腺中的表达量显著增加，说明血蓝蛋白是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。KK-42处理可明显诱导肝胰腺中血蓝蛋白基因的表达和血淋巴中血蓝蛋白含量，说明KK-42激活了血蓝蛋白这一重要的免疫因子，由此提高了虾的免疫能力。　　 首次从血细胞中克隆出酚氧化酶原(proPO)基因cDNA全长序列，全长2428bp，包含71bp的5UTR、344bp的3UTR和2013bp的开放阅读框(ORF)。ORF编码671个氨基酸，预测蛋白分子量为76.5KDa，理论等电点(pl)约为7.31;含有2个保守的铜离子结合位点和6个组氨酸残基、1个蛋白酶水解位点和硫酯样的基序(GCGWPRHM);含有3个血蓝蛋白结构域;与罗氏沼虾proPO的相似性最高，为93％，与其他甲壳动物proPO相似性为50％左右。该基因表达具有组织特异性，血细胞最高，肝胰腺有较弱表达，肌肉、鳃、肠、大颚器官和卵巢不表达:血细胞proPO基因的表达量在蜕皮前期(DO/I)最高。嗜水气单胞菌可诱导proPO基因的表达以及PO活力，提示该基因是参与机体免疫防御反应的一种重要分子。KK-42预处理通过诱导MnproPOmRNA的表达和PO活力，激活了日本沼虾重要的防御系统——proPO系统。　　 结论:咪唑类物质KK-42能够提高日本沼虾感染嗜水气单胞菌后的成活率，KK-42预处理可以上调MnSOD、血蓝蛋白和酚氧化酶原等免疫因子的基因表达，诱导相应的酶活力，这可能是成活率提高的机制之一。