研究背景:随着人口的增长和老龄化,以及经济的发展,与城市化环境的改变,癌症的发病率和死亡率不断的上升,根据GLOBOCAN的估计,2012年全球约有1410万新的癌症病例和820万人癌症死亡病例。多年来,癌症已成为发展中国家越来越重的负担,目前这些国家癌症患者人数和癌症死亡人数占全球癌症病例的57%和65%。癌症也已成为我国人口死亡的主要原因,是我国公共卫生面临的一大棘手的问题。通过我国国家癌症中心登记处(National Central Cancer Registry of China)提供的数据显示,2015年中国约新增392.9万癌症病例和238.8万癌症死亡病例。其中,结直肠癌新增约38.8万癌症病例和18.7万死亡病例。2017年美国将新增135,430例结直肠癌患者,结直肠癌是美国第四大常见癌症,是西方国家癌症死亡的第二大原因。终末期癌症患者往往表现为极度消瘦、厌食、乏力、体能差甚至卧床,即出现恶液质症状。据报道,80%左右的胃癌或胰腺癌,50%左右的结肠癌、肺癌或前列腺癌,以及约40%的乳腺癌患者随癌症进展而出现恶液质。癌症恶液质的特点主要是脂肪组织和骨骼肌的损失,从而导致体重显著下降。进而导致癌症治疗耐受性降低,降低患者的生活质量和寿命。有数据显示30%以上的癌症患者是因恶液质死亡的。在癌症恶液质中,蛋白质的合成和降解之间存在着复杂的相互作用。癌症恶液质的一个重要特征是骨骼肌质量的逐渐减少,同时伴随着身体脂肪的损失。肌肉消耗极大地降低了生活质量,这可能会是导致致命后果的原因。癌症引起宿主肌肉质量损失的机制目前被认为是多因素的。各种激素、细胞因子和癌症源性因子已被证明通过几个主要的细胞内信号转导系统,在正常和疾病状态下影响肌肉蛋白平衡。AKT/p70S6K分子通路的激活与肌肉的生长密切相关,另一方面,肌肉萎缩的原因可能是FOXO(或Forkhead)家族、NF-κB和Smad转录因子的激活,NF-κB可被TNF-α,TWEAK和IL-1等激活,这些分子可促进蛋白质降解。FOXO3a诱导肌肉萎缩相关的基因表达,特别是肌肉特异性泛素化连接酶MAFbx/Atrogin-1和MuRF-1,从而促进肌原纤维分解和自噬基因的激活。Myostatin和Activin A/B是TGF-β家族的成员。研究结果表明,Myostatin可抑制AKT,进而抑制其下游p70S6K通路,阻止蛋白质合成。在人以及多种动物中敲出肌肉生长抑制素,会导致骨骼肌肥大,而在成年小鼠中过表达肌肉生长抑制素则可导致全身肌肉萎缩。另外,在骨骼肌中激活TNF-α/TAK-1信号通路,可发现激活素A上调。这些TGF-β分子结合到ActRIIB受体上,起到信号级联放大,导致MAFbx和MuRF-1表达增加,进而促进肌纤维蛋白的降解。癌症恶液质是一种多因素的综合征,越来越多的证据表明,临床治疗恶液质的手段仍不能满足需要,营养支持虽不能完全逆转恶液质,但在疾病的预防和治疗中发挥关键作用。最近,研究者关注左旋肉碱(L-carnitine,LC)。左旋肉碱是调节长链脂肪酸β氧化的关键物,研究发现左旋肉碱在癌症恶液质患者的血清中明显减少。在癌症恶液质患者中,低水平的血清左旋肉碱被认为是恶液质进展的重要原因。补充左旋肉碱已被证明可以改善患者疲劳和生活的质量。例如,左旋肉碱已被证明可改善包括老年痴呆、神经退行性病变、艾滋病、肌病、心肌病和肾衰竭等几种疾病患者的病情。更好的理解恶病质的潜在机制,加上有效的治疗方案,将改善癌症患者生命质量。左旋肉碱改善癌症恶液质的机制尚需进一步阐明。在此,我们将对左旋肉碱对癌症恶液质的改善作用及其可能的机制进行研究和探讨。本研究结果显示,给荷瘤小鼠灌胃10 mg/kg的左卡尼汀被证明对癌症恶液质有良好的治疗效果,并可显著减少骨骼肌的损耗和小鼠血清血脂(包括胆固醇和甘油三酯)的浓度。实验方法:1.构建CT26荷瘤裸鼠模型:在本研究中,我们用结肠腺癌细胞(CT26)接种于裸鼠的右侧腹股沟处,每天测量食物摄入量、小鼠体重和癌症大小。旨在评估左旋肉碱对结肠腺癌癌症小鼠模型中小鼠癌症恶液质的改善作用。2.生化分析,血清总胆固醇、甘油三酯以及血糖等生化参数采用全自动生化分析仪进行分析。3.酶联免疫吸附测定法(ELISA),ELISA法检测血清IL-1、IL-6和TNF-α等细胞因子的浓度。4.苏木精-伊红染色(He)法,He染色观察腓肠肌肌纤维粗细和肿瘤组织的病理。5.蛋白免疫印迹法(Western Blotting,WB),肉碱干预后,Western Blotting检测肉碱对肌肉组织中Myostatin、AKT、p-AKT、p70S6K、p-p70S6K、FOXO3a、p-FOXO3a、MAFbx、MuRF1等相关蛋白表达的影响。研究结果:1.接种CT26细胞第10天后,裸鼠出现恶液质症状。在恶液质小鼠模型中,连续18天给小鼠灌胃1 mg/kg左旋肉碱和10 mg/kg左旋肉碱,10 mg/kg的左旋肉碱可以增加小鼠腓肠肌肌肉重量,促进小鼠腓肠肌肌纤维增粗。2.1-10 mg/kg/d左旋肉碱对癌症恶液质小鼠的食欲和肿瘤生长没有影响。3.1-10 mg/kg/d左旋肉碱降低癌症恶液质小鼠血糖的水平,使血清中总胆固醇水平和甘油三酸酯水平增加,提示了左旋肉碱对糖代谢的抑制和对脂质代谢的促进。同时,左旋肉碱可使腓肠肌中CPT1和PDK4的表达增加,说明左旋肉碱通过CPT1促进脂质代谢,通过PDK4抑制糖代谢。4.1-10 mg/kg/d左旋肉碱可以降低血清细胞炎症因子IL-1、IL-6浓度;10 mg/kg/d左旋肉碱可以降低血清IL-1浓度;1-10 mg/kg/d左旋肉碱不影响血液TNF-α水平。5.小鼠癌症恶液质状态下,肌肉合成的相关蛋白分子P-AKT/AKT,P-p70S6K/p70S6K表达下调,而肌肉降解的一些标志分子Myostatin、P-FOXO3a/FOXO3a、MuRF1和MAFbx等蛋白表达都上升。6.10 mg/kg左旋肉碱可促进AKT磷酸化,使骨骼肌中P-AKT/AKT的蛋白表达上调。同时,活化的AKT促进其下游分子p70S6K磷酸化,上调p-p70S6K/p70S6K的蛋白表达。7.左旋肉碱可抑制Myostatin蛋白分子的表达。8.左旋肉碱可促进FOXO3a磷酸化,并抑制FOXO3a的合成,进而抑制骨骼肌中最重要的两种泛素化酶MuRF1和MAFbx蛋白分子的表达。结论:左旋肉碱在抑制骨骼肌萎缩中发挥重要作用。左旋肉碱激活与肌肉生长相关的AKT/p70S6K通路,并抑制FOXO3a。FOXO3a诱导肌肉特异性泛素连接酶MAFbx和MuRF1,促进肌纤维萎缩,通过AKT/p70S6K和AKT/FOXO3a途径改善癌症恶液质。