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花粉在显花植物的受精以及繁殖中扮演至关重要的角色,通过花粉运送雄配子到胚囊从而完成双受精。花粉萌发和花粉管生长是植物有性生殖的关键步骤,也是研究极性细胞生长的理想体系。在花粉管生长中发挥作用的已知或未知蛋白的亚细胞定位能够帮助人们了解该蛋白质的功能。细胞器本身在某些突变花粉管中的形态结构和动态也值得研究。研究蛋白质亚细胞定位较为常用的方法有:生物信息学预测定位、免疫组织化学定位法、共分离标记酶辅助定位法、蛋白质组学定位技术以及融合报告基因定位法。荧光报告基因法是将目的基因与易于检测的荧光报告基因融合,表达融合蛋白,通过荧光报告基因的表达产物来对目的蛋白进行定位。荧光报告基因法能使蛋白质保持其天然特性,并且对活细胞不产生毒害、且具有灵敏性高的优点,并能够在活体中观察蛋白质的动态变化。荧光蛋白通常包括绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)、红色荧光蛋白(Red Fluorescent Protein,RFP)、黄色荧光蛋白(Yellow Fluorescent Protein,YFP)和蓝色荧光蛋白(Blue Fluorescent Protein,BFP)等。细胞器标记是基于已经确认的特异定位序列,能够定位在目的细胞器上,可以通过标记分子荧光来观察细胞器的结构,就荧光的颜色而言以绿色荧光居多。尽管目的蛋白荧光模式可能与某个细胞器结构相似,但只有通过观察目的蛋白和细胞器标记的共定位情况,才能确定未知蛋白的确切亚细胞定位。稳定表达花粉管细胞器标记的转基因株系较少,通常只用一种荧光或一种植物抗性我们根据已经确认的特异亚细胞定位序列与荧光蛋白融合,通过花粉中特异启动子LAT52启动表达,构建了一套花粉特异亚细胞定位标记。我们构建了包括内质网(endoplasmic reticulum,ER)、高尔基体(Golgi apparatus)、反面高尔基体管网结构(trans-Golgi network,TGN)、液泡前体(pre-vacuolar compartment,PVC)、裂解液泡(lytic vacuole,LV)共5个细胞器的荧光标记转基因株系。使用了绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)和红色荧光蛋白(mCherry)2种不同的荧光蛋白。所有的标记均接于2个不同的载体pME18和pBI121中。前者具有植株潮霉素抗性,后者具有植株卡那霉素抗性。不同颜色荧光和不同植株抗性的多种组合可以满足共定位研究的需要。利用激光共聚焦显微镜观察这套花粉特异亚细胞定位标记在拟南芥花粉中的表达,我们发现在花粉中内质网标记荧光均匀地分布在整个花粉管的胞质中。高尔基体、反面高尔基体管网结构、液泡前体标记均位于胞质中呈点状分布。裂解液泡标记则标记了数个环状结构,定位于花粉管的胞质中。这套拟南芥花粉特异亚细胞定位标记对于花粉管中细胞器的结构与动态变化的观察,以及共定位研究未知蛋白有很大意义。