研究背景和目的强直性脊柱炎(Ankylosing spondylitis, AS)是一种骨骼及软组织慢性进行性炎症性疾病。它主要对脊柱各个关节及邻近肌腱、韧带造成损伤。同时在不同程度上对骶髂关节和周围关节造成慢性进行性炎症反应。在AS患者中,约有60%以上存在外周关节发病,尤以髋关节为主。随病程进展关节周围骨质破坏,继而出现骨性强直乃至失去活动功能,极大影响患者生活质量。在AS早期病理表现以肌腱、韧带、关节囊等韧带附着点炎症为主,继而软组织受累,出现周围骨侵蚀破坏。晚期附着点处新骨形成骨赘,在关节内间隙中形成骨桥,逐渐发展成整个关节纤维化、骨性强直,最终导致关节畸形,失去正常活动功能。AS外周关节骨化的具体病因尚不明确。早期的观点认为它是炎症引起的成骨机制紊乱,导致局部组织成骨能力增强。而随着对其发病机制及过程的深入研究,认为AS患者外周关节骨化是一个相互作用且多阶段的复杂过程。目前对于其病因的推测有如下几种：1.信号转到通路异常2.炎症作用3.应力作用4.基因免疫异常。而目前AS外周关节骨性强直的研究主要集中于如何调控炎症与细胞的代谢。阻止炎症途径,减少细胞刺激,延缓关节骨性强直的异位改变。外周关节作为人体的主要滑膜关节,是AS最常累及的外周关节。关节滑膜覆于关节腔内面、股骨颈周围,包绕着关节囊内血管,产生滑液,润滑减少关节面摩擦并为关节软骨提供成分及运输代谢产物。而.当滑膜病变将会导致关节腔内环境发生明显改变。因此,AS的外周关节发病与关节内滑膜的病理改变密切相关。在AS外周关节发病的早期患者中调查发现,关节腔内即出现以滑膜炎为主要的临床表现。通过关节镜下或直视下行关节手术治疗时,发现患者关节腔内滑膜增生且并发滑膜炎症性改变。同时影像学、超声等方面的辅助检查也为AS早期诊断提供参考依据,证实滑膜病理性炎症改变在关节发病中的作用。随病程进展,在各种细胞因子的诱导作用下,局部组织血管化,使滑膜、处聚集分化出了多种潜能的前体干细胞,关节滑膜细胞向骨性细胞分化,逐渐演变为成骨细胞、破骨细胞等,在这些细胞的释放的细胞因子及相互作用下,滑膜逐渐发生骨性化生,成为新骨和骨赘的增生部位。骨硬化蛋白(sclerostin, SOST)是一种由SOST基因编码的糖蛋白,因其存在“胱胺酸结构”,与wnnt信号转导通路中的共受体LRP5/6具有较高的亲和性,可与LRP5/6受体竞争性结合,达到抑制信号转导通路作用。在对wnnt诱导蛋白聚合和齐聚的研究中发现,介导LRP6受体可影响或增强wnt信号的活性。SOST和wnt信号通路联系紧密,可能通过LRP受体影响wnt信号通路。而SOST与LRP5/6的竞争性结合拮抗wnt/β-catenin信号通路不能完全解释SOST的抑制活性。近年来随着SOST的研究深入,发现其可通过增加RANKL表达调节骨细胞的活性。可见,SOST在骨形成的活动中作为一个广泛的参与者而存在。本研究利用免疫组化技术将AS外周关节骨化强直的滑膜组织与正常人滑膜组织进行染色比较,并通过pcr和wb检测方法从基因和蛋白表达水平检测骨化强直关节滑膜中SOST和μ表达的差异,以及所代表的wnt信号通路所表达的关系,进一步明确其在骨化发展过程中可能存在的作用。利用基因转染技术,建立过表达SOST腺病毒载体转染正常人滑膜细胞,研究过表达SOST后对滑膜细胞的成骨能力的改变,及其生理功能的异同。第一章SOST和β-catenin在AS骨化关节滑膜组织中的表达及作用研究目的观察AS外周关节骨性强直患者滑膜组织中SOST和β-catenin表达,探讨SOST和β-catenin在AS外周骨化关节滑膜中的作用和机理。方法1.收集AS髋关节骨化强直滑膜15例,股骨颈骨折髋关节滑膜18例。2.使用免疫组织化学染色方法对滑膜标本进行SOST、β-catenin特异性染色定位。3.采用Real time-PCR法对滑膜标本样本SOST、β-catenin基因表达进行检测。4.采用Western-blot法对滑膜标本样本蛋白SOST、β-catenin表达进行检测。5.免疫组化结果判断标准:SOST、β-catenin以细胞浆或细胞核着色成棕黄色或者棕褐色为阳性。采用Image-pro plus 6.0图像处理分析系统对免疫组化进行定量分析,所有切片放大倍数为200x。每张切片观察6个视野,结果以单个视野下平均光密度IOD来表示。6.Real time-PCR结果判断标准：以相对定量方法分别检测两组滑膜标本中SOST、β-catenin的基因表达值。7.Western blot结果判断标准：以半定量方法,检测两组滑膜标本中SOST、 β-catenin蛋白灰度值,分别与对应的α-tubulin蛋白灰度值比较,计算两者比值。8.数据采用均数±标准误表示,数据使用SPSS 19.0统计软件进行分析,计量资料用t检验,相关性采用Spearman相关分析。所有统计学分布取P<0.05时,认为差异有统计学意义。结果1.免疫组化结果显示：免疫组化检测显示SOST和β-catenin在AS滑膜组中的强阳性表达,主要分布于成纤维样滑膜细胞胞浆中,且其IOD值高于正常滑膜组,差异有显著性意义(P<0.01)。认为检测指标骨化强直组与正常滑膜组不同,强直组高于正常组；AS滑膜组织中SOST与β-catenin表达呈正相关性(r=0.413,P<0.01)。2.通过Real time-PCR检测显示：AS滑膜组中SOST和β-catenin基因含量大量表达。经相对定量分析显示：AS滑膜组的SOST和β-catenin蛋白水平显著高于正常滑膜组(P<0.05)。3.通过Western blot检测发现,AS滑膜组中大量表达SOST和β-catenin蛋白。经灰度值分析及半定量结果显示：AS滑膜组的SOST和β-catenin蛋白水平显著高于正常滑膜组(P<0.05)。结论1.AS外周骨化关节滑膜组织中SOST、β-catenin的异常表达与骨化相关2.AS外周骨化关节滑膜组织中其骨化能力主要在滑膜成纤维细胞上体现3.AS外周关节骨化其滑膜组织可能依赖于wnt/β-catenin信号通路发挥作用第二章AS骨化关节滑膜组织中成骨作用与破骨作用的表达关联性目的观察AS外周关节骨性强直患者滑膜组织中OPG和RANKL蛋白及破骨细胞特异性染色TRAP的表达,探讨OPG和RANKL在AS外周骨化关节滑膜中与成骨作用和破骨作用的关联性。方法1.收集AS髋关节骨化强直滑膜15例,股骨颈骨折髋关节滑膜18例。2.使用免疫组织化学染色方法对滑膜标本进行OPG和RANKL特异性染色定位及破骨细胞特异性染色TRAP的表达。3.采用Real time-PCR法对滑膜标本样本OPG和RANKL基因表达进行检测。4.采用Western-blot法对滑膜标本样本蛋白OPG和RANKL表达进行检测。5.免疫组化结果判断标准：OPG和RANKL以细胞浆或细胞核着色成棕黄色或者棕褐色为阳性。采用Image-pro plus 6.0图像处理分析系统对免疫组化进行定量分析,所有切片放大倍数为200×。每张切片观察6个视野,结果以单个视野下平均光密度IOD来表示。6.Real time-PCR结果判断标准：以相对定量方法分别检测两组滑膜标本中OPG和RANKL的基因表达量。7.Western blot结果判断标准：以半定量方法,检测两组滑膜标本中OPG和RANKL蛋白灰度值,分别与对应的a-tubulin蛋白灰度值比较,计算两者比值。8.数据采用均数±标准误表示,数据使用SPSS 19.0统计软件进行分析,计量资料用t检验,相关性采用Spearman相关分析。所有统计学分布取P<0.05时,认为差异有统计学意义。结果1.免疫组化结果显示：免疫组化检测显示OPG和RANKL在AS滑膜组中的强阳性表达,主要分布于成纤维样滑膜细胞胞浆中,且其IOD值高于正常滑膜组,差异有显著性意义(P<0.05)。认为检测指标骨化强直组与正常滑膜组不同,强直组高于正常组；2.破骨细胞特异性TRAP染色在AS组滑膜中表达较正常滑膜组明显增高。3.通过Real time-PCR检测显示：AS滑膜组中大量表达OPG的基因,而RANKL未见明显升高。经相对定量分析显示：AS滑膜组的OPG基因水平显著高于正常滑膜组(P<0.05)。4.通过Western blot检测发现,AS滑膜组中大量表达OPG蛋白,而ANKL未见明显升高。经灰度值分析及半定量结果显示：AS滑膜组的OPG蛋白水平显著高于正常滑膜组(P<0.05)。结论1.AS外周关节的骨化强直过程可与成骨细胞、破骨细胞密切相关,其中成骨细胞在骨化中发挥主要作用。2.AS外周骨化关节的滑膜组织中表达以成骨能力为主的作用。3.AS外周骨化关节的滑膜组织中破骨能力或受到抑制。第三章转染SOST基因后对人成纤维样滑膜细胞的wnt通路功能影响及成骨作用与破骨作用表达关联性研究目的探讨人成纤维样滑膜细胞(human fibroblast-like synoviocytes,HFLS)过表达骨硬化蛋白(sclerostin, SOST)后,细胞功能的改变及SOST所依赖的wnt信号转导途径对细胞的作用影响。HFLS过表达SOST后,细胞功能变化及其成骨作用和破骨作用的表达关联性。方法1.将HFLS细胞常规培养于体积分数含15%胎牛血清的DMEM培养基中,在37℃、饱和湿度计含5%C02的培养箱中传代培养。2.用携带SOST基因的腺病毒感染成纤维样滑膜细胞作为过表达组,同时设立空白载体组及空白组作为对照,72h后荧光显微镜检测基因的表达情况确认转染效率,5天后检测SOST、β-catenin、OPG和RANKL基因及蛋白的表达变化3.采用Real time-PCR法对滑膜标本样本SOST-β-catenin、OPG和RANKL基因表达进行检测。4.采用Western-blot法对滑膜标本样本蛋白SOST、β-catenin、OPG和RANKL表达进行检测。5.Real time-PCR结果判断标准：以相对定量方法分别检测两组滑膜标本中SOST、β-catenin、OPG和RANKL的基因表达量。6.Western blot结果判断标准：以半定量方法,检测两组滑膜标本中SOST、 β-catenin、OPG和RANKL蛋白灰度值,分别与对应的a-tubulin蛋白灰度值比较,计算两者比值。7.数据使用SPSS 19.0统计软件进行分析,计量资料用t检验,相关性采用Spearman相关分析。所有统计学分布取P<0.05时,认为差异有统计学意义。结果1.realtime-PCR结果显示：与空白组及空白载体组相比,过表达组SOST、 β-catenin、OPG基因表达量与空白组及空白载体组存在显著差异,过表达组高于空白载体组及空白对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。过表达组RANKL基因表达量与空白组及对照组存在显著差异,且低于空白载体组及空白对照组(p<0.05)2.Western blot结果显示：与空白组及空白载体组相比,过表达组SOST、 β-catenin、OPG蛋白表达量与空白组及空白载体组存在显著差异,过表达组高于空白载体组及空白对照组,差异有显著性意义(P<0.05)。过表达组RANKL蛋白表达量与空白组及对照组存在显著差异,且低于空白载体组及空白对照组(p<0.05)结论1.滑膜组织中SOST过表达可能导致wnt/β-catenin信号的活化。2.滑膜组织中SOST过表达可使成骨作用增强,破骨作用减弱。3成纤维样滑膜细胞可能是AS滑膜发生骨化强直病理改变的作用细胞。