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目的成功构建Testin基因重组慢病毒过表达载体,检测其转染人胚肾上皮细胞系293T的表达情况,并将其修饰人胎盘间充质干细胞(hPMSCs),构建稳定表达Testin蛋白的hPMSCs细胞株。 方法 将聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因Testin插入慢病毒载体pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro中,构建慢病毒表达质粒pHBLV-Testin并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α;经PCR、 DNA 测序和比对分析后,用LipofiterTM脂质体将重组慢病毒表达载体pHBLV-Testin和辅助包装质(pSPAX2,pMD2G)共转染 293T细胞包装成重组慢病毒颗粒,浓缩上清并测定病毒滴度。将成功包装的Testin过表达慢病毒载体(pHBLV-Testin)转染293T ,用蛋白质印迹法(Western Blot)检测Testin 蛋白的表达情况。用pHBLV-Testin 重组慢病毒载体转染 hPMSCs细胞并确定最佳感染复数(MOI),经western blot检测相关蛋白表达,经CCK-8检测感染的hPMSCs细胞增殖活性,以空载体组(pHBLV-null)及无任何处理组作为对照。 结果 经测序和比对分析证实,成功构建重组慢病毒质粒 pHBLV-Testin 。慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒共转染 293T 细胞后荧光显微镜下观察细胞内可见明显的绿色荧光,测定滴度为2.0×108TU/ml。Western blot 结果示Testin基因蛋白在293T细胞内稳定表达。pHBLV-Testin 重组慢病毒载体转染 hPMSC后,荧光显微镜下可直接观察到绿色荧光蛋白,其最适MOI值为50。Western blot法证实感染pHBLV-Testin细胞内Testin蛋白表达较空载体组(pHBLV-Null)及无任何处理组多,且差异有统计学意义(P<0,05)。CCK-8结果显示 pHBLV-Testin. hPMSCs ,pHBLV-null. hPMSCs 及hPMSCs组间细胞的增殖无明显差异(P>0.05)。 结论 成功构建了 Testin基因重组慢病毒过表达载体,使得Testin基因稳定表达,并成功获得目的基因TESIN在过表达样品hPMSCs细胞中稳定表达,为后续体内探究其对结直肠癌荷瘤鼠的作用奠定了基础。 为后期研究其修饰人胎盘间充质干细胞对结肠癌的作用奠定基础。