人Testin基因过表达慢病毒载体的构建及修饰人胎盘间充质干细胞的研究

来源 :宁夏医科大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:kaezhu1111
下载到本地 , 更方便阅读
声明 : 本文档内容版权归属内容提供方 , 如果您对本文有版权争议 , 可与客服联系进行内容授权或下架
论文部分内容阅读
目的成功构建Testin基因重组慢病毒过表达载体,检测其转染人胚肾上皮细胞系293T的表达情况,并将其修饰人胎盘间充质干细胞(hPMSCs),构建稳定表达Testin蛋白的hPMSCs细胞株。  方法 将聚合酶链反应(PCR)扩增目的基因Testin插入慢病毒载体pHBLV-CMVIE-ZsGreen-Puro中,构建慢病毒表达质粒pHBLV-Testin并转化大肠杆菌感受态细胞DH5α;经PCR、 DNA 测序和比对分析后,用LipofiterTM脂质体将重组慢病毒表达载体pHBLV-Testin和辅助包装质(pSPAX2,pMD2G)共转染 293T细胞包装成重组慢病毒颗粒,浓缩上清并测定病毒滴度。将成功包装的Testin过表达慢病毒载体(pHBLV-Testin)转染293T ,用蛋白质印迹法(Western Blot)检测Testin 蛋白的表达情况。用pHBLV-Testin 重组慢病毒载体转染 hPMSCs细胞并确定最佳感染复数(MOI),经western blot检测相关蛋白表达,经CCK-8检测感染的hPMSCs细胞增殖活性,以空载体组(pHBLV-null)及无任何处理组作为对照。  结果 经测序和比对分析证实,成功构建重组慢病毒质粒 pHBLV-Testin 。慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒共转染 293T 细胞后荧光显微镜下观察细胞内可见明显的绿色荧光,测定滴度为2.0×108TU/ml。Western blot 结果示Testin基因蛋白在293T细胞内稳定表达。pHBLV-Testin 重组慢病毒载体转染 hPMSC后,荧光显微镜下可直接观察到绿色荧光蛋白,其最适MOI值为50。Western blot法证实感染pHBLV-Testin细胞内Testin蛋白表达较空载体组(pHBLV-Null)及无任何处理组多,且差异有统计学意义(P<0,05)。CCK-8结果显示 pHBLV-Testin. hPMSCs ,pHBLV-null. hPMSCs 及hPMSCs组间细胞的增殖无明显差异(P>0.05)。  结论 成功构建了 Testin基因重组慢病毒过表达载体,使得Testin基因稳定表达,并成功获得目的基因TESIN在过表达样品hPMSCs细胞中稳定表达,为后续体内探究其对结直肠癌荷瘤鼠的作用奠定了基础。  为后期研究其修饰人胎盘间充质干细胞对结肠癌的作用奠定基础。
其他文献
目的:慢性脑血流低灌注与老龄化及阿尔茨海默病的认知功能变化极为相关,而Hos在老龄化和阿尔茨海默病中又发挥了重要作用。本课题旨在建立慢性脑血流低灌注模型,研究Hos在大鼠
信号传导与转录活化因子3(STAT3)信号通路在人类很多肿瘤细胞中都持续异常活化。在信号传递过程中主要由STAT3的Coiled-coil结构域和SH2结构域调控和介导与受体上磷酸化肽段结