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目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种慢性神经系统退行性疾病,以进行性记忆和认知功能减退为主要临床表现。AD的特征性病理改变为β-淀粉样蛋白(amyloid protein,Aβ)在神经细胞外沉积形成老年斑。Aβ是AD的主要致病因素。AD不仅是老年人常见的疾病,也是糖尿病(diabetes mellitus,DM)病人高发的疾病。这对糖尿病病人无疑是雪上添霜。因此,亟待弄清糖尿病病人高发AD的原因,找到干预措施。基于以下两个事实:(1)报道显示,AD病人脑中极长链脂肪酸(very long chain fatty acids,VLCFA,≥C22)水平增加。VLCFA对神经细胞具有脂毒性,可以导致细胞活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)产生增多,氧化应激增强。而氧化应激是目前公认的Aβ生成增多的重要机制之一。(2)糖尿病是糖脂代谢紊乱疾病。我们假设,在糖尿病状态下,脂代谢的紊乱会使脑中的VLCFA聚集,进而引起氧化应激,使Aβ异常生成增加,最终导致认知障碍,糖尿病AD发生。为了证实此假设,本实验用高脂饮食加小剂量STZ的方法诱导2型糖尿病的大鼠模型,观察2型糖尿病大鼠的学习记忆情况,以及脑中Aβ的生成、氧化应激水平和VLCFA的变化,探讨VLCFA在2型糖尿病大鼠脑Aβ生成中的作用,为预防及治疗糖尿病AD提供新的实验依据。方法:1实验动物以本实验室侯连国等人制备的2型糖尿病大鼠的脑组织为实验材料。实验动物分为对照组(Con)和2型糖尿病组(DM)。2 Morris水迷宫检测大鼠的学习记忆能力用上海吉量软件科技有限公司Morris水迷宫,采用定位航行试验和空间探索试验,分别记录大鼠的平均逃避潜伏期、穿越原平台位置的次数和第一次到达原平台的时间,以评估大鼠的学习记忆能力。3 ELISA检测脑组织Aβ40、BACE1的含量用日本IBL公司ELISA试剂盒进行测定,脑Aβ40的含量以pg/mg protein表示;脑BACE1的含量以ng/μg protein表示。4实时定量PCR检测脑APP和BACE1的m RNA表达用美国OMEGA公司总RNA提取试剂盒提取大鼠脑组织总RNA。以18S r RNA做内参,实时定量PCR测定APP、BACE1 m RNA的相对表达量。5免疫组织化学分析脑组织APP的蛋白水平对大鼠脑组织石蜡切片进行免疫组织化学染色,分析APP的蛋白表达水平。6气相色谱分析脑组织VLCFA提取各组大鼠脑组织脂肪酸,用日本岛津公司气相色谱仪(GC-2010 Plus)分析每种VLCFA的含量。7 TBA法测定脑组织丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)比色法进行测定,脑MDA的含量以nmol/mg prot表示。8 Western blot检测NOX4,p47和HO-1的蛋白表达提取大鼠脑组织总蛋白,Western blot测定NOX4,p47和HO-1蛋白的相对表达量。9数据处理实验数据采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,对测定结果进行正态性与方差齐性检验,数据用`x±SD表示。逃避潜伏期数据采用重复测量的方差分析(One-way repeated measures ANOVA)进行统计,其它数据采用Student’s t检验分析两组之间均数的统计学差异。以P<0.05表示差异有统计学意义。结果:1 DM大鼠的学习记忆能力下降与Con组相比,虽然DM组大鼠第一天的逃避潜伏期有所延长,但随后几天均没有明显差异。DM组大鼠,与Con组相比,穿越原平台次数明显减少,第一次到达原平台时间明显延长,差异有统计学意义(P<0.01)。表明,2型糖尿病大鼠的学习记忆能力下降。2 DM大鼠脑中Aβ生成增加2.1脑组织Aβ的含量ELISA结果显示,Con组和DM组大鼠脑组织Aβ40含量分别为:Con(4.87±0.71 pg/mg protein),DM(6.22±0.81 pg/mg protein)。DM组脑组织Aβ含量较Con组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。表明,糖尿病大鼠脑Aβ水平增加。2.2脑组织APP的表达实时定量PCR结果显示,DM组脑组织APP m RNA的表达水平(0.046±0.014)较Con组(0.025±0.007)明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)。免疫组化结果显示,DM组脑组织中APP阳性细胞数量、着色深度较Con组明显增加;图像分析显示,DM组大鼠脑中APP阳性细胞的平均光密度值较Con组显著升高,差异有统计学意义(P<0.001)。表明,糖尿病大鼠脑APP的m RNA和蛋白表达均增加。2.3脑组织BACE1的表达实时定量PCR结果显示,DM组脑组织BACE1 m RNA的表达水平(0.912±0.038)较Con组(0.661±0.118)明显升高,差异有统计学意义(P<0.001)。ELISA结果显示,DM组脑组织BACE1的含量(0.95±0.09 ng/μg protein)较Con组(0.78±0.06 ng/μg protein)明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。表明,糖尿病大鼠脑BACE1的m RNA和蛋白表达均增加。以上结果表明,糖尿病大鼠脑中APP的β-分泌酶裂解途径上调,从而导致Aβ生成增加,出现类似AD的病理改变。3 DM大鼠脑中C26:0水平增加气相色谱结果显示,DM组C26:0水平(44.90±13.94μmol/g tissue)较Con组(18.38±6.29μmol/g tissue)显著升高,差异有统计学意义(P<0.001);C22:0、C24:0含量在DM组与Con组之间差异无统计学意义(P>0.05)。表明,糖尿病大鼠脑极长链脂肪酸C26:0水平增加。4 DM大鼠脑中C26:0水平与Aβ含量呈正相关相关分析结果显示,脑组织C26:0水平与Aβ含量呈正相关(r=0.557,P=0.016)。表明,糖尿病大鼠脑C26:0水平增加与Aβ生成增加有关。5 DM大鼠脑氧化应激增强TBA结果显示,DM组脑组织MDA的含量(2.19±0.27 nmol/mg protein)较Con组(1.83±0.19 nmol/mg protein)明显升高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示,DM组大鼠脑组织氧化应激指标NOX4,p47和HO-1的蛋白表达水平均高于Con组。表明,糖尿病大鼠脑氧化应激水平增强。6 DM大鼠脑中C26:0水平与MDA含量呈正相关相关分析结果显示,脑组织C26:0水平与MDA含量呈正相关(r=0.504,P=0.033)。表明,糖尿病大鼠脑C26:0水平增加与氧化应激水平增强有关。结论:1 2型糖尿病大鼠的认知功能障碍与脑中C26:0增加所引起的Aβ增加有关。2 Aβ的增加与氧化应激引起的APP和BACE1的表达上调有关。