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脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus,EMCV)是一种重要的人兽共患病病原。其宿主范围十分广泛,能感染包括人在内的多种哺乳动物、鸟类及昆虫等。目前,猪已成为该病毒感染最普遍的动物,感染后,可引起仔猪的急性致死性心肌炎和母猪的繁殖障碍等疾病,不仅给养猪业造成巨大经济损失,也潜在威胁着人类健康。EMCV属于微RNA病毒科心病毒属,是单股正链的RNA病毒,病毒粒子无囊膜,衣壳由VP1-VP4四种结构蛋白组成,在四种结构蛋白中以VPl的抗原性最强,并可刺激机体产生中和抗体。本研究采用纯化的EMCV免疫小鼠,成功获得10株抗EMCV VP1蛋白和1株抗VP2蛋白的单克隆抗体；通过对所得单克隆抗体针对抗原表位的分析,精确定位了VP1蛋白上可能存在的5个B细胞线性表位；本研究还以重组VPl蛋白和辣根过氧化物酶标记的VP1蛋白单抗为基础,建立了检测EMCV抗体的阻断ELISA方法,为EMCV临床诊断方法的建立和VPl蛋白相关功能的进一步研究奠定了基础。具体研究内容包括：1.猪源脑心肌炎病毒单克隆抗体的制备与生物学特性鉴定利用纯化的猪源脑心肌炎病毒(EMCV NJ08株)经BEI灭活后免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤细胞技术,共获得11株能稳定分泌抗EMCV抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1D1、2A2、2A5、2B6、4B2、4B9、4E2、4F1、5A1、5A11和5G1。经间接ELISA测定,11株杂交瘤细胞培养上清效价分别为1：1600、1：6400、1：3200、1:6400、1:1600、1:6400、1:3200、1:6400、1:6400、1:6400和1:3200,接种小鼠的腹水效价分别为1：1.63×106、1：3.28×106、1：3.28×106、1：1.13×106、1：1.63×106、1：1.63×10。、1：5.63×10。、1：3.28×106、1：1.63×106、1：3.28×106和1：1.63×106。单克隆抗体亚类鉴定结果显示,1D1、2A2、2A5、4B2、4B9、4F1、5A1、5A11和5G1这9株单抗的亚类为IgGl,2B6和4E2这2株单抗的亚类为IgG2b,所有单抗的轻链均为κ型。Westernblot鉴定结果表明1D1、2A2、2A5、2B6、4B2、4B9、4E2、4F1、5A1、5A11和5G1能特异性识别病毒的VP1蛋白,2B6能特异性识别病毒的VP2蛋白。间接免疫荧光试验证明,11株单抗都具有良好的特异性,均能识别EMCV。本研究所获得的单克隆抗体将为EMCV检测方法的建立和病毒结构蛋白抗原表位的分析提供技术储备。2.猪脑心肌炎病毒NJ08株VP1蛋白B细胞表位的鉴定为了对实验室已获得的17株抗猪脑心肌炎病毒VP1蛋白的单克隆抗体所针对的抗原表位进行精确定位,本研究利用原核表达系统,分别表达了41个重组的截短VP1蛋白；首先经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白获得成功表达后,再通过间接ELISA和Western blot方法精确定位了17株单克隆抗体所识别的抗原表位；结果显示,单抗6E11、7A7和7C9识别的位点是V(2)ENAEK(7),单抗2C8识别位点A(17)DFVA(21),单抗1D1、1F3、2A2、2A5、4B2/4B9/4F1/5A1/5A11和5G1识别的位点是F(19)VAQPVY(25),单抗1G8和3A9识别的位点为P(42)IGAFTVK(49),单抗4E2识别的抗原位点是F(36)YDRSSPIGAFTVKS(50)。将鉴定的5个抗原表位与16株不同来源的EMCV参考毒株进行序列比对分析,结果发现表位A(17)DFVA(21)和F(19)VAQPVY(25)在所参考的毒株中高度保守,表位P (42)IGAFTVK(49)和F(36)YDRSSPIGAFTVKS(50)在国内EMCV分离株中十分保守,与国外各分离株相比较,在不同毒株的不同位置分别出现一个氨基酸的突变；表位V(2)ENAEK(7)除与GXLC分离株和三株美国分离毒株在VP1蛋白的第7个氨基酸(K7→R7)发生突变以外,与其余毒株之间完全一致。以上结果丰富了EMCV VP1蛋白抗原表位图谱,为VP1蛋白相关功能的进一步研究和EMCV诊断方法的建立奠定了基础。3.猪脑心肌炎病毒阻断ELISA抗体检测方法的建立与应用应用纯化的EMCV重组VP1蛋白和辣根过氧化物酶标记的VP1蛋白单克隆抗体建立了检测EMCV抗体的阻断ELISA方法。经条件优化,确定抗原最佳包被条件为1μg/mL的浓度,4℃包被12h；最佳封闭条件为1%BSA,37℃封闭3h；待检血清最佳作用条件为稀释度1：1,37℃作用2h；酶标单抗最佳作用条件为稀释度1：15000,37℃作用0.5h；TMB最佳显色时间为37℃5min。通过对30份EMCV阴性血清进行阻断ELISA检测,结果经统计学分析,确定本方法的判定标准为当阻断率PI≥39.10%时为阳性,PI≤29.46%时为阴性,29.46%<PI<39.10%时为可疑。应用本方法对30份临床血清样品进行检测,以EMCV血清中和试验为标准,结果表明两种方法的符合率为90%,且阻断ELISA的敏感性高于血清中和试验。使用该方法检测猪口蹄疫病毒(FMDV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV2)等参考阳性血清,结果均为阴性；批内和批间重复性试验结果显示变异系数均小于10%,说明本方法具有较好的特异性和重复性；应用该阻断ELISA方法检测不同地区送检的580份临床血清,总阳性检出率为41.03%；表明该方法具有较好的应用前景。