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对动物进行精确基因编辑是一项低效,但具有重要价值的工作。近年来,规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced palindromic repeats/CRISPRassociated 9,CRISPR/Cas9）等基因编辑工具的出现,为制备精确编辑的动物模型提供了高效手段。虽然CRISPR/Cas9等基因编辑技术能高效产生双链断裂（Double-strand breaks,DSB）进而介导有效的基因敲除操作（Knock-out,KO）,但由同源定向修复（Homology directed repair,HDR）介导的定点敲入（Knock in,KI）效率仍然十分低下。提高基因组KI效率对家畜遗传育种、人类疾病模型制备和基因治疗等具有重要意义。本研究通过干扰DNA修复通路相关基因表达、优化DNA供体模板、小分子化合物调控DNA修复途径等方式,建立高效基因组KI方法;同时通过体细胞核移植技术（Somatic cell nuclear transfer,SCNT）成功制备了腮腺特异性表达葡聚糖酶、木聚糖酶和植酸酶的基因编辑猪,为降低养猪业粪氮磷排放提供了一种有价值的育种材料。本论文的主要研究结果总结如下:第一部分:敲低Ku70/80基因表达提高猪原代细胞的KI效率针对非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）途径的Ku70/80基因编码序列分别设计3对si RNA,通过实时荧光定量PCR和western blot验证其干扰效果,发现所有si RNA对靶基因均表现出显著的抑制作用,其中Ku70-si RNA2和Ku80-si RNA3抑制效果最好。随后通过共转Ku70/80 si RNA和EGFP报告载体,发现敲低Ku70/80基因显著提高猪胎儿成纤维细胞（Porcine fetal fibroblasts,PFFs）HDR、SSA（Single strand annealing）和ssODN（Single-stranded oligodeoxyribonucleotide）介导的DNA修复效率;同时干扰Ku70/80基因表达可以进一步提高HDR介导的内源基因KI效率。此外通过CRISPRi（CRISPR interference）和Ng Agoi（Ng Ago interference）敲低Ku70/80基因表达,发现Ng Agoi比CRISPRi的干扰效果更理想。CRISPRi只有部分sg RNA（Single guide RNA,sg RNA）可以下调Ku70/80基因表达;而Ng Agoi几乎所有sg DNA（single guide DNA）均可显著抑制靶基因表达75%以上,但流式细胞术结果显示,CRISPRi敲低Ku70/80可显著提高HDR介导的修复效率,而Ng Agoi提高效果却不明显。第二部分:小分子化合物提高猪原代细胞KI效率组蛋白去乙酰化酶（Histone deacetylase,HDAC）、DNA-PKcs等蛋白是DNA修复的直接参与者。本研究使用DNA-PKcs抑制剂PIK-75、HDAC抑制剂（HDAC inhibitors,HDACis）TSA和PCI-24781处理PFFs可以显著提高HDR、SSA和ssODN介导的KI效率,且具有剂量依赖性。此外,Hind III酶切和T7E1检测发现,PIK-75显著提高Rosa26和DMD基因ssODN介导的KI效率。胞浆显微共注射Cas9蛋白、sg RNA和ssODN模板至猪孤雌胚胎,发现TSA可以显著提高胚胎的KI效率,达到14.29%（6/42）。随后通过流式细胞术检测细胞周期,发现TSA可以诱导细胞同步化至有利于发生HDR的G2/M期,表现出与nocodazole相似的细胞周期同步化效应。通过western blot和Chip-q PCR发现,TSA通过增加NHEJ途径Ku70/80蛋白和非经典NHEJ（Alternative-end joining,Alt-EJ）途径Parp1蛋白乙酰化水平,抑制DSB末端连接;因此TSA可能通过调控NHEJ途径乙酰化水平和阻滞细胞周期为HDR提供有利环境。第三部分:高通量筛选提高哺乳动物细胞KI效率的小分子化合物为了获得更加有效且效果稳定的提高KI效率的小分子化合物,利用流式细胞术高通量筛选自然提取和细胞周期/DNA损伤的1094种小分子化合物,发现13种小分子化合物在BHK-21和HEK293T细胞中能同时提高线性双链DNA（Linear double strand DNA,lds DNA）、环状双链DNA（Circular double strand DNA,cds DNA）和ssODN介导的KI效率。同时进一步验证4种效果最好的候选小分子化合物irinotecan、docetaxel、mitomycin C和nocodazole在不同哺乳动物细胞发生KI的最佳浓度和联合使用方式,发现小分子化合物提高细胞HDR效率具有剂量依赖性,有一定的细胞株差异,且具有协同作用。同时这些小分子化合物对胚胎KI效率也具有显著提升效果。通过蛋白组测序发现mitomycin C可能通过靶向CDK1、CCNA2、CCNB1和MAD2L1等细胞周期相关因子,为HDR提供有利条件。通过过表达CDK1、CCNA2、CCNB1和MAD2L1基因,表明其可以显著提高KI效率,但不同物种的CDK1对KI效率影响不一致,其中人源和猪源的CDK1可以显著提高KI效率,而仓鼠源CDK1对KI效率没有影响。第四部分:利用CRISPR/Cas9制备KI基因编辑猪尽管上述方法可以显著提高KI效率,但具有一定的细胞毒性,因此提高KI效率的方法仍然需要优化。本实验通过构建靶向猪Cep112和Rosa26基因的CRISPR/Cas9系统,筛选出最高切割效率的sg RNA。随后将不同同源臂长度的供体模板和CRIPSR/Cas9共转染至PFFs,2周后挑取EGFP表达单克隆细胞团。结果显示,使用长短同源臂组合方式可以将约17 kb的DNA片段KI猪Cep112位点,最高效率达13.61%±1.22%,且显著高于靶向Rosa26基因位点的效率。随后利用Cep112 KI细胞系进行SCNT制备基因编辑猪,发现KI猪（#705）成功在腮腺特异性表达葡聚糖酶、木聚糖酶及植酸酶。综上所述,本研究通过敲低Ku70/80基因表达、小分子化合物筛选等方式显著提高了哺乳动物细胞中CRISPR/Cas9介导的KI效率;同时利用CRISPR/Cas9和优化的同源重组模板成功对猪Cep112基因位点进行KI操作,制备了腮腺特异性表达葡聚糖酶、木聚糖酶及植酸酶的基因编辑猪,为了降低种猪氮磷污染提供了一种优势育种材料。同时本研究也为高效培育具有其他优良经济形状的家畜,制备人类疾病的动物模型和基因治疗研究提供借鉴。