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该研究采用农杆菌介导的转基因方法,旨在构建水稻T-DNA插入的Enhancer trap突变体库.该突变体库正用于基因调节序列的分离,丧失功能突变体的筛选及作为基因表达的模式系创造获得的功能的突变体.获得的主要研究结果如下:⒈建立了农杆菌介导的粳稻品种"中花11号"和"中化15号"高效遗传转化体系,抗性愈伤率为70﹪-80﹪,大约60﹪的抗性愈伤再生成植株.高效的遗传转化体系为大规模创造水稻T-DNA插入突变体库奠定了基础.⒉总共获得两个品种的34843个独立转化子,大约94﹪的转化植株PCR检测为阳性,Southern blot结果表明,平均每个转化子含有2.0个T-DNA拷贝,估计水稻基因组中有65505个位点已被T-DNA标记.⒊组织化学检测不同组织/器官(叶、叶鞘、穗轴、雄蕊、小穗轴、子房、稃、根等)表明,不同Enhancer trap系中报告基因GUS呈不同的表达模式,有的只在一个组织中表达,有的在多个组织中表达,有的在所有组织中均表达.⒋抽提叶片GUS为阳性的Enhancer trap系中叶片总RNA,RT-PCR结果显示GAL4/VP16基因均有表达.组织原位杂交证明GAL4/VP16基因与BoGUS基因呈相同的表达模式,且BoGUS基因的表达最高,说明该Enhancer trap系统在检测基因表达上更为敏感.⒌T<,1>代家系GUS染色结果表明,大多数家系内GUS基因表达的分离比例符合孟德尔3:1分离比,T<,1>代GUS阳性植株已被Southern blot所证实,Enhancer trap系中T-DNA及GUS基因的表达能稳定遗传.而且,T<,1>代植株与相应T<,0>代植株中报告基因呈相同的表达模式,结果表明GAL4/VP16-UAS元件在水稻基因组中可能不存在甲基化修饰现象.⒍采用质粒拯救方法分离T-DNA侧翼序列200多条,大多数序列能在水稻基因组数据库中检索到同源序列.对侧翼序列分析发现T-DNA在整合到水稻基因组的过程中存在不同程度的缺失.⒎分析在雄蕊和雌蕊中报告基因特异不表达的三个Enhancer trap系的侧翼序列,分离了三个在该部位特异不表达候选基因的启动子,启动子的功能验证正在进行.⒏构建了以GFP为报告基因的Enhancer trap载体.