论文部分内容阅读
还原型谷胱甘肽(GSH)是一种由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸组成三肽化合物，在生物体内广泛存在且具有清除自由基、抗氧化、解毒、抑制HIV等功能。因此GSH被广泛的应用于临床医药、食品加工、化妆品等行业。目前，工业上可以利用发酵或酶合成的方法生产GSH，由于我国还没有实现GSH的大规模生产，其主要依赖于外国进口。因此，实现我国GSH的工业化生产迫在眉睫。微生物发酵法是生产GSH的最主要的方法。在大多数真核细胞和革兰氏阴性细菌中，谷胱甘肽的生物合成主要是通过两步依赖于ATP的酶催化反应。L-谷氨酸、L-半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（GSH I）的作用下合成γ-谷氨酰半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合酶(GSHII）的作用下，与甘氨酸反应生成谷胱甘肽。在谷胱甘肽的生产过程中，GSH I受到GSH的反馈抑制。最近的一些研究表明，在一些致病性的革兰氏阳性细菌中存在一种双功能酶—γ-谷氨酰半胱氨酸合酶-谷胱甘肽合酶（GshF），该酶可以单独催化谷胱甘肽的生成，且对反馈抑制不敏感。本文旨在于利用生物合成的方法获得整合异源GshF基因的高产GSH酵母菌株，再通过培养条件的优化，提高GSH的产量。具体研究内容如下：（1）高产GSH酿酒酵母菌的构建将克隆的GshF基因分别与含有不同启动子（GAP-SCP、GAP-PC、PGK1、GAL1）的载体连接形成融合基因，获得含有不同启动子的表达载体，将表达载体转化酿酒酵母W303-1B。通过G418抗性筛选标记筛选获得阳性克隆w303B/GshF-GAP-SCP、w303B/GshF-GAP-PC、w303B/GshF-PGK1、w303B/GshF-GAL1，然后利用ABD-F柱前衍生法进行代谢产物GSH的分析。结果表明，通过摇瓶培养，w303B/GshF-GAP-SCP为高产GSH酿酒酵母工程菌。（2）高产GSH酿酒酵母工程菌w303B/GshF-GAP-SCP的最适培养条件优化在摇瓶水平上通过单因素实验，考察培养时间、培养基中葡萄糖含量对GSH产量的影响。得到最佳发酵条件：发酵温度30℃，摇床转速200rpm，接种量OD600=0.15，葡萄糖含量为20g/L，培养时间为3d。GSH产量可达到150mg/L。（3）氨基酸前体添加对工程菌生产GSH的影响在摇瓶水平上考察三种前体氨基酸的添加对GSH产量的影响。结果表明，氨基酸前体的添加可以显著提高工程菌胞内GSH的产量，w303B/GshF-GAP-SCP合成GSH的最高产量可达250mg/L。（4）外泌蛋白（Adp）在高产谷胱甘肽酿酒酵母中的整合表达本实验构建了酵母自身的外泌蛋白基因Adp同源整合表达载体，转化酵母获得工程菌株w303B/GshF-GAP-SCP/Adp，在摇瓶水平上考察Adp对工程菌GSH产量的影响。结果表明，Adp的整合能够影响菌体生物量，但具有一定的外泌功能。（5）工程菌w303B/GshF-GAP-SCP的10L发酵罐放大培养工程菌w303B/GshF-GAP-SCP9#以10%的接种量接种于装液量为4L YPD培养基的10L发酵罐中，进行发酵罐的放大培养，结果表明工程菌的谷胱甘肽合成能力升高。