背景白内障,又称眼球晶状体的部分或全部浑浊化,可导致视力下降,大多数表现为视觉灵敏度、相对灵敏度下降,以及眩光。可分为早发型(先天性)白内障和遗传性白内障。先天性白内障危害特别严重,因为其有可能抑制视力的发育,导致永久失明。在过去的十年间,通过在大家族中使用遗传连锁分析策略,对先天性白内障的遗传背景的了解已有了相当大的进步。大约有40多个和白内障相关的遗传位点已被知晓,其中的25个已经过鉴定,而突变位点的数量已超过100。突变导致的发育性白内障主要涉及一些结构和伴侣蛋白,包括α-,β-,γ-晶体蛋白。另外一组包括晶状体特异性跨膜间隙连接蛋白GJA3和GJA8,以及膜蛋白MIP和LIM2.第三组包括一些和晶状体相关的转录因子蛋白,如HSF4,PITX3,MAF, PAX6和FOXE3。在人体内,hsf4基因的错义突变可导致白内障,而带有靶向hsf4基因缺失的小鼠,表现出晶状体纤维细胞分化上的缺陷和早期的白内障症状。HSF4属于热休克转录因子家族(HSF),能和热休克原件结合(HSE),在外界不同刺激的情况下转录激活下游的热休克蛋白(HSP70,HSP90,HSP27,HSP82)。HSF4拥有两个剪切变体：Hsf4a有转录抑制活性,而Hsf4b具有转录激活作用。近来的研究发现Hsf4b在晶状体纤维细胞的成熟中起到重要作用。虽然Hsf4的作用已经明了,但是其调控转录的机制还不是太清楚。为了进一步了解控制Hsf4b转录活性的分子机制,我们进行了酵母双杂交试验,用Hsf4b作为诱饵,发现了一个新的和Hsf4b反应的蛋白BAT1(又名BAT1,56kDaU2AF65-associated protein)。BAT1蛋白作为DEAD盒式家族的一员,是一个具有ATP依赖的RNA解旋酶。BAT1既具有RNA激活的ATP结合和水解活性,又具有ATP依赖的RNA解旋活性。研究不同组织中的BAT1蛋白发现,BAT1蛋白不仅在前体mRNA的剪切中起到重要作用,而且在mRNA的核内输出及细胞质mRNA的定位上也有重要作用。本实验通过构建一系列表达BAT1蛋白的载体,来验证-BAT1和hsf4b的相互作用。然后通过luciferase assay实验来验证-BAT1对hsf4b下游基因的调控作用。目的本研究通过构建表达BAT1蛋白的一系列载体,来验证-BAT1和hsf4b的相互作用,确定其作用部位,以及BAT1对hsf4b下游相关基因的调控作用。方法1.应用PCR技术,获得表达BAT1的cDNA序列,利用Bamh I和Not I酶切位点将BAT1基因分别克隆入真核表达载体pEBG, pcDNA3.0,得到pEBG-BAT1, pcDNA3.0-T7-BAT1质粒。利用Bamh Ⅰ和Sal I酶切位点将BAT1基因克隆入pGEX-4T3—4T3原核表达载体,得到pGEX-4T3-BAT1质粒。2.测序证确后,将上述pEBG-BAT1, pcDNA3.0-T7-BAT1质粒转染293T细胞,进行真核表达。利用SDS-PAGE和Western blot实验鉴定体内BAT1蛋白的表达。将pGEX-4T3-BAT1质粒转入BL21感受态细胞,诱导表达BAT1蛋白的克隆。利用SDS-PAGE实验鉴定体外表达的BAT1蛋白。3.通过体内,体外pull-down assay来验证BAT1蛋白和hsf4b的蛋白相互作用,以及通过pull-down assay来验证BAT1和hsf4b的哪个功能区作用。4.通过luciferase assay实验,来验证BAT1对hsf4b下游基因α B-晶体蛋白(alpha B-crystallin)的影响。结果1.构建了表达BAT1的真核载体pEBG-BAT1, pcDNA3.0-T7-BAT1,原核载体pGEX-4T3-BAT1,并获得了相应的表达蛋白。2.体内pull-down assay实验验证了BAT1和hsf4b具有相互作用；体外pull-down assay实验也验证了BAT1和hsf4b具有相互作用。并且初步证明了BAT1和hsf4b的C-端功能区有相互作用。3.Luciferase assay实验初步说明了BAT1对hsf4b下游基因α B-晶体蛋白(alpha B-crystallin)有抑制作用。结论1.BAT1蛋白和hsf4b在体内和体外都有结合作用2.BAT1蛋白和hsf4b的C-端功能区有相互作用3.BAT1对hsf4b下游基因α B-晶体蛋白(alpha B-crystallin)的表达有抑制作用