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研究背景： 随着牙髓再生治疗术的开展应用，临床上已有越来越多患牙髓炎或根尖周炎的年轻恒牙经治疗后，牙根继续发育以及根尖孔闭合。其中，位于根尖部牙乳头组织中的根尖乳头干细胞（Stem cells from apical papilla，SCAPs），由于具有高效的多向分化潜能，且在外界刺激时可从根尖区域迁移至受损部位进行增殖、分化，因此在牙髓再生治疗术中起重要作用。自噬是细胞内普遍存在的一种溶酶体依赖性的降解途径，对细胞内稳态的维持具有重要作用，可参与防御细胞感染及影响细胞免疫反应。研究证实，自噬参与血管生成、神经生成、骨生成等过程，对维持干细胞的稳态、自我更新能力、多向分化潜能具有重要作用。细胞外刺激因素如饥饿、炎性因子（TNF-α）等，均能激活细胞自噬水平的活化。TNF-α是参与牙髓、根尖周炎症的重要细胞因子，本课题组前期研究已证实TNF-α可促进SCAPs的增殖并参与调控其成骨/成牙本质分化能力。研究报道，TNF-α可诱导多种细胞自噬水平的活化，如巨噬细胞、骨骼肌细胞、破骨细胞等，然而关于 TNF-α作用下人 SCAPs自噬水平的变化，以及自噬对其凋亡、分化能力影响的研究仍知之甚少。了解TNF-α作用下自噬对人SCAPs的影响，有利于我们更深入的理解炎症状态下人SCAPs的生物学特性改变，从而有助于为临床牙髓再生治疗术提供新思路。 研究目的： 本实验目的在于初步探讨 TNF-α对人 SCAPs自噬水平的影响及其可能相关的机制；初步探讨自噬对TNF-α作用下人SCAPs的凋亡及成骨分化的影响，为后续对炎症微环境下自噬与人SCAPs分化关系的研究提供一定的参考。 方法： 1、TNF-α影响人根尖乳头干细胞自噬水平及相关机制的初步研究 体外通过改良组织块培养法和有限稀释法培养获得人SCAPs。蛋白免疫印迹法（Western blot）、GFP-LC3质粒转染、吖啶橙染色检测不同浓度TNF-α（5、10 ng/mL）作用下SCAPs的自噬水平改变。Western blot法检测TNF-α（5、10 ng/mL）作用下SCAPs的ERK1/2通路的磷酸化水平，及TNF-α（5 ng/mL）+U0126（0、10、20、30μM）分别作用下SCAPs的自噬水平及ERK1/2通路的磷酸化水平。 2、抑制自噬对TNF-α作用下人根尖乳头干细胞凋亡及成骨分化影响的初步研究 TNF-α（5 ng/mL）、TNF-α（5 ng/mL）+3-MA（5 mM）分别处理SCAPs， Western blot、GFP-LC3质粒转染检测SCAPs的自噬水平；CCK-8法检测细胞活力；流式细胞仪检测细胞凋亡。TNF-α（5 ng/mL）、TNF-α（5 ng/mL）+3-MA（5 mM）分别处理SCAPs并诱导成骨向分化，qRT-PCR检测成骨向分化第3、7、14天时成骨相关基因ALP、BSP、OCN的表达。 结果： 1、Western blot、GFP-LC3转染、吖啶橙染色结果均表明，5、10 ng/mL TNF-α作用下SCAPs的自噬水平显著上调（P＜0.05），且10 ng/mL TNF-α较5 ng/mL TNF-α诱导SCAPs自噬的能力更强（P＜0.05）。Western blot显示5、10 ng/mL TNF-α作用下SCAPs的p-ERK/ERK水平升高（P＜0.05）；20、30μM U0126处理能有效降低p-ERK/ERK及LC3-II/β-actin水平（P＜0.05），10μM U0126作用下p-ERK/ERK及LC3-II/β-actin水平与对照组无明显差异。 2、Western blot和GFP-LC3质粒转染结果显示，自噬抑制剂3-MA能显著抑制TNF-α作用下SCAPs自噬水平的活化（P＜0.05）。CCK-8结果显示：TNF-α处理组细胞活力与对照组无明显差异，TNF-α+3-MA处理组细胞活力较TNF-α处理组下降（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果显示：TNF-α处理组细胞凋亡率与对照组无明显差异，TNF-α+3-MA处理组细胞凋亡率较TNF-α处理组显著上调（P＜0.05）。qRT-PCR结果显示：TNF-α处理组的成骨相关基因ALP、OCN、BSP表达量在第3、7、14天较对照组均增加（P＜0.05）；TNF-α+3-MA处理组的ALP、BSP表达量在第3、7、14天较TNF-α处理组均降低（P＜0.05），OCN的表达量在第3、7天较TNF-α处理组降低（P＜0.05）。 结论： 1. TNF-α能诱导SCAPs自噬水平的活化，可能与ERK1/2通路相关。 2.自噬可能对TNF-α作用下的SCAPs起到细胞保护作用，对抗细胞凋亡，提高细胞生存率。 3.自噬的抑制将下调TNF-α作用下SCAPs分化过程中成骨相关基因的表达，抑制SCAPs的成骨向分化，提示自噬在TNF-α作用下SCAPs的成骨分化过程中具有重要作用。