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研究背景:随着人们生活方式和饮食结构的改变,糖尿病尤其是2型糖尿病的患者越来越多。据统计,2型糖尿病是导致晚期肾脏疾病、失明和心血管疾病的主要诱因,也是神经病变的常见诱导因素。糖尿病神经病变包括外周神经病变,如痛觉超敏,也包括中枢神经系统病变如痴呆。但是,临床上确诊的具有认知功能障碍的糖尿病患者,其大脑内并没有发现阿尔茨海默症的典型病理特征。虽然至今为止已经做了大量的研究,但是这种并发症的发病机理还不是很清楚,临床上也缺乏合适的方法来诊断、治疗和预防。因此,进一步研究其机制,寻找有效的早期诊断的生物标志物和治疗靶点非常重要。研究目的:2型糖尿病记忆功能损伤及其分子机制,主要研究内容包括:(1)验证2型糖尿病大鼠是否存在记忆功能损伤。(2)验证海马区小胶质细胞是否参与2型糖尿病大鼠记忆功能的损伤。(3)探讨2型糖尿病大鼠海马区P2X4受体分子表达变化及其机制。实验方法:(1)选用成年雄性SD大鼠作为实验动物,高脂饲料喂养连续3周后,在第3周应用小剂量STZ(30mg/kg)腹腔单次注射,诱导2型糖尿病大鼠模型。(2)应用Morris水迷宫和T迷宫实验来检测2型糖尿病大鼠的学习与记忆水平,应用Von Frey Filament(VFF)和热刺激仪来检测大鼠的后肢痛觉阈值。(3)应用免疫荧光实验来观察海马区细胞的状态,P2X4受体的定位,以及2型糖尿病大鼠海马区小胶质细胞的激活状态。(4)应用Western blot和Real-time PCR技术检测大鼠海马区和其它脑区如ACC和BLA中P2X3R、P2X4R、P2X7R和ATM的蛋白表达和mRNA表达水平。(5)应用长片段扩增PCR(LA-PCR)技术检测大鼠海马区p2x4r基因的DNA损伤情况。(6)按照2型糖尿病大鼠的体重(50mg/kg),每天一次腹腔注射米诺环素(Mino),从Morris水迷宫实验开始前第二天持续到Morris水迷宫第5天为止。实验结果:(1)高脂饮食大鼠体重增长明显快于正常饮食大鼠,STZ注射后1周,大鼠空腹血糖升高至16mmol/L以上,并至少持续至第11周。IPITT测试大鼠胰岛素耐受情况,相对于正常大鼠,高脂饮食加STZ注射的大鼠对胰岛素不敏感。(2)STZ腹腔注射后第8周Morris水迷宫实验中,2型糖尿病大鼠的逃离水面潜伏期、运动距离与正常大鼠没有差异,但穿梭平台次数明显更少,在平台所在象限的停留时间更短,以及在运动过程中距离平台的平均距离更大。(3)STZ注射后第8周的T迷宫实验中,2型糖尿病大鼠选择正确率要明显低于正常大鼠,而且Win-shift failure和Lose-shift failure两类错误的犯错数显著多于正常大鼠。(4)2型糖尿病大鼠海马区神经元和星形胶质细胞的状态与正常组的大鼠没有差异,但激活的小胶质细胞数量要明显更多。(5)腹腔注射米诺环素后,2型糖尿病大鼠海马区激活的小胶质细胞的数量明显减少。更重要的是,腹腔注射米诺环素后,2型糖尿病大鼠在Morris水迷宫测试时运动过程中距离平台的平均距离明显减小。(6)相比较正常组的大鼠,P2X4R蛋白表达以及mRNA转录水平在2型糖尿病大鼠海马区明显降低,而ATM的蛋白表达显著升高。(7)LA-PCR实验发现,2型糖尿病大鼠海马区P2X4R的DNA扩增片段要明显少于正常组的大鼠。但Mino处理不改变ATM和P2X4R的表达。结论:(1)2型糖尿病大鼠存在记忆功能损伤。(2)海马区小胶质细胞的过度激活参与了2型糖尿病大鼠记忆功能损伤。(3)2型糖尿病大鼠海马区小胶质细胞上的p2x4r基因发生了DNA损伤,导致了P2X4R蛋白表达下调,这可能是2型糖尿病大鼠海马区小胶质细胞的过度激活和记忆功能损伤的分子基础。