随着抗生素的大量应用,细菌耐药性的产生和新生抗生素的筛选瓶颈使得抗生素的应用受到一定的制约。近年来的研究发现,抗菌肽(Antimicrobal peptides)以其独特的作用机理和分子特性成为抗生素最为理想的替代药物。抗菌肽CM4是由本实验室从中国家蚕中诱导获得的线性两亲的、α-螺旋肽,具有广谱的抗菌作用,且对正常细胞没有毒性,因此具有良好的应用前景,为了扩大抗菌肽CM4的应用领域,我们通过商业化的高效原核表达系统来优化CM4的表达纯化,在此基础上通过对抗菌肽CM4的改造或修饰来提高其抗菌活性,并研究了CM4抗绿脓杆菌的作用机制。本课题研究具体共分为5个部分：1抗茵肽CM4的表达、纯化针对实验室前期所用融合表达系统切割效率低或产量低的缺点,通过使用美国LifeSensors公司开发的SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier)融合蛋白表达系统,将CM4、2CM4和3CM4的cDNA亚克隆至pSUMO载体中,通过优表达条件,SUMO蛋白酶的高效切割,Ni柱亲和纯化后得到了纯度>95%的抗菌肽CM4,且重组的抗菌肽与化学合成的CM4有相同的抗菌活性。本实验首次运用SUMO表达系统表达天蚕素类抗菌肽CM4,与实验室前期表达相比,不但缩短了工艺时间,还提高了表达量,最终CM4的产量为24mg/l。2抗菌肽CM4的分子改造和修饰为了提高抗菌肽CM4的抗菌活性,我们对CM4进行结构改造和修饰。通过生物信息学分析,对抗菌肽CM4进行分子改造,包括截取CM4、Magainin Ⅱ和Melittin的部分序列形成杂合肽,并对杂合肽上的几个特定位点氨基酸进行点突变,对抗菌肽CM4的分子修饰包括对CM4的C-端进行天冬酰胺修饰。通过SUMO表达系统纯化这些目的蛋白,进行活性鉴定与比较发现,改造后的杂合肽和突变体活性不如亲本CM4强,而C-端加了天冬酰胺的CM4N比亲本抗菌肽CM4具有更强的活性。这是首次对抗菌肽CM4的分子改造和修饰的研究,并筛选得到了抗菌活性更强的抗菌肽CM4N。3抗菌肽CM4N稳定性优化抗菌肽CM4N对蛋白酶比较敏感,为了提高其稳定性,我们对CM4N进行了p环糊精(p-CD)包合。利用常规溶液法制备超分子化合物β-CD/CM4N,并对超分子化合物进行了紫外-可见光谱分析、差示热扫描(DSC)分析和抗菌活性分析,研究发现超分子化合物β-CD/CM4N提高了CM4N对蛋白酶的稳定性和贮藏稳定性,这是首次对β-CD改善抗菌肽CM4N稳定性的研究。4抗菌肽CM4N体外抗绿脓杆作用针对绿脓杆菌的多重耐药性,我们研究了抗菌肽CM4N抗绿脓杆菌的作用机制。通过研究CM4N的抑菌浓度与抑菌时间曲线,确定了CM4N的最低抑菌浓度(20μM),在此基础上结合扫描电镜与透射电镜观察了CM4N对绿脓杆菌细胞膜的作用,及抗菌肽CM4N与绿脓杆菌基因组DNA或RNA的作用,首次在分子与细胞水平上研究了抗菌肽CM4N抗绿脓杆菌的作用机制。抗菌肽CM4N通过与绿脓杆菌细胞膜结合后,在膜上形成孔洞引起细胞内容物外泄而死亡,此外CM4N还可以与绿脓杆菌核酸类物质结合,影响其复制与翻译,这是否在抗绿脓杆菌中发挥了重要影响还需要进一步的实验。5抗菌肽CM4N对脓毒症小鼠的治疗效应体外研究发现抗菌肽CM4N可以有效的杀伤绿脓杆菌,为了研究CM4N对体内绿脓杆菌的杀伤作用,我们通过建立小鼠绿脓杆菌感染模型,观察动物的基本体征变化、存活率变化、组织病理改变,初步评价CM4N对绿脓杆菌感染小鼠的治疗效果。研究发现CM4N显著提高了绿脓杆菌感染小鼠的存活率,减轻了肺、肝等重要器官的损伤。为了延长CM4N在小鼠体内的半衰期及减少血清对抗菌肽活性的影响,实验中对CM4N进行了环糊精包合。