雄激素是主要由睾丸间质细胞合成分泌的类固醇激素,具有影响胚胎发育、维持生精作用、刺激生殖器官的生长发育、促进男性副性征出现并维持其正常形态、维持性欲等多种作用,并参与多种行为及认知过程的调节。传统的类固醇作用理论认为,脂溶性的雄激素通过细胞膜后,与特异的胞内雄激素受体(i AR)结合,形成激素—受体复合物,再作用于特定DNA上的雄激素反应原件,启动并调控相关基因的转录,影响m RNA的表达及蛋白质的合成。这一过程称为雄激素的基因组效应,需时较长,往往需要数小时或数天。人们对基因组效应的认识较早,研究相对较深入,又称其为经典途径。随着研究的深入,大量证据表明雄激素作用于多种组织、细胞的生物学效应难以用基因组模式解释,表现为不依赖于传统基因转录调控的快速非基因组效应。通常把具有以下特点中的一方面或数方面的生物学效应称为非基因组效应。(1)作用速度较快,常在数秒钟或数分钟内完成。雄激素通过基因组途径发挥作用时,需要一定的时间进行基因转录和蛋白质合成,因此所需的时间较长,一般为数小时或数天。(2)胞膜介导,牵涉到嵌入或联合的膜受体或结合蛋白。雄激素与不能通过细胞膜的大分子(如牛血清白蛋白)偶联后,也能发挥作用。(3)不被经典的雄激素受体拮抗剂氟他胺所阻断(除非拮抗剂具有的结构与雄激素胞膜结合位点相关,是雄激素基因组和非基因组受体共同的部分)。(4)无直接转录/翻译机制的激活,即使在有DNA转录和蛋白质合成抑制剂存在的情况下,也能发挥作用。目前认为雄激素的细胞生物学效应可能存在三种模式:(1)胞内受体介导的经典的基因组效应;(2)细胞膜结合位点或膜受体介导的特异性非基因组效应;(3)通过与细胞膜的理化交互影响而发挥非特异性非基因组效应,这种作用模式不通过受体起作用,而是与细胞膜蛋白或脂质非特异性结合,改变了细胞膜的理化特性(如流动性)或某些膜蛋白的微环境等。本课题主要研究海马神经元细胞膜雄激素结合位点及其介导的特异性非基因组效应。雄激素对机体多种组织、细胞存在不依赖传统基因组途径的快速作用,其中以雄激素对睾丸、前列腺癌细胞、骨骼肌、骨组织和免疫细胞的非基因组效应研究最为多见。虽然雄激素对脑的发育、性别二态性、学习记忆、认知功能以及情绪等发挥的重要调节作用已得到公认。但从目前研究报道来看,有关雄激素的非基因组效应在对神经元结构和功能的维持、对受损神经元的保护及其在神经系统疾病发生发展中的作用的研究报道非常少,需要学者进行大量的科学研究来阐明其中的生物学效应。雄激素与突触可塑性调节具有相关性。研究报道,雄激素对于维持雄性动物海马正常的树突棘密度有非常重要的作用。数年来我们研究团队致力于雄激素对认知功能的改善作用及其对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)防治的突触可塑性机制研究。研究发现,雄激素水平下降可降低海马突触可塑性,加重学习记忆力减退、认知功能障碍。而雄激素补充治疗可明显改善海马突触可塑性。从而推断出雄激素对学习记忆、认知能力的改善作用可能与促进突触结构可塑性有关。但是,雄激素对突触可塑性影响的研究还存在着很多空白和争议,需要进行不懈探索。快速老化小鼠(SAM)是一种近交系衰老模型鼠,根据老化速度和特征分为抗快速老化系SAMR和快速老化系SAMP两种品系。SAMP8小鼠是SAMP系中的一个亚系,表现为随年龄增长而发生的快速老化和学习记忆力减退、认知功能障碍及与AD患者类似的脑部病理改变,现已从多方面证实了SAMP8小鼠是研究AD较理想的自然发病模型。国外Foold等研究发现,12月龄SAMP8小鼠血清总睾酮较4月龄下降了71%,睾酮植入能明显改善12月龄SAMP8小鼠学习记忆能力,说明SAMP8小鼠认知功能的减退是老龄和睾酮水平下降相互作用的结果。我们利用SAMP8小鼠进行了AD相关的研究,证实该动物模型可用来研究雄激素与学习记忆、认知功能的相互关系。近些年来,相关研究报道提示雄激素快速的非基因组效应参与了突触可塑性的调节。Tabori等用免疫电镜观察了海马结构雄激素受体的分布,发现AR免疫阳性产物不仅存在于海马神经元胞核和胞质内,也存在于树突棘、突触终末和突触终末的突触囊泡内。这不仅为雄激素核外膜受体存在提供了直接证据,也为雄激素通过膜受体介导的非基因组效应影响突触可塑性提供了依据。Hatanaka等[研究报道了雄激素快速促进了体外培养海马薄片CA3区树突棘增加。目前对海马神经元雄激素膜受体及其介导的雄激素对海马突触可塑性影响的研究尚处于起始阶段,本课题将深入这一研究,以SAMP8小鼠为动物模型,从以下三方面进行探讨阐明:一,寻求海马神经元细胞膜雄激素结合位点存在的证据。二,揭示雄激素非基因组效应对海马神经元树突棘密度的影响。三,阐明雄激素非基因组途径对突触可塑性蛋白的影响。第一部分SAMP8小鼠海马神经元细胞膜雄激素结合位点的定位及其特目的:应用SAMP8小鼠为研究对象,根据与大分子偶联的雄激素不能穿过细胞膜进入细胞,体内、外观察T-BSA-FITC与海马神经元胞膜结合情况,验证海马神经元细胞膜雄激素结合位点的存在。此外,阐明海马神经元雄激素膜受体与i AR是否存在特征性差异。经典的i AR抑制剂氟他胺能否抑制雄激素膜受体的快速作用;抗i AR抗体能否与海马神经元膜受体相结合等。方法实验一SAMP8小鼠海马神经元细胞膜雄激素结合位点的定位实验选用7月龄健康雄性SAMP8小鼠30只,随机分为对照组、BSA-FITC组和T-BSA-FITC组。其中,T-BSA-FITC组根据药物作用时间分为15min组,0.5h组,1.0h组和2.0h组,每组小鼠各5只。SAMP8小鼠侧脑室立体定位与埋管,在验证注射靶位侧脑室定位准确后,行侧脑室微量注射给药。对照组给予PBS 0.5h;BSA-FITC组给予BSA-FITC 0.5h;T-BSA-FITC 15min组,0.5h组,1.0h组和2.0h组分别给予T-BSA-FITC 15min,0.5h,1.0h和2.0h。药物注射完毕后,各组小鼠断头取脑,冰上迅速分离海马组织。采用网搓法制备流式细胞术样本。采用流式细胞仪进行上机检测。对样本细胞进行流式荧光强度分析。实验二雄激素受体拮抗剂氟他胺对雄激素与SAMP8小鼠海马神经元细胞膜结合位点结合的影响实验选用7月龄健康雄性SAMP8小鼠20只,随机分为对照组、BSA-FITC组、T-BSA-FITC组和F+T-BSA-FITC组,每组小鼠各5只。SAMP8小鼠侧脑室立体定位与埋管,在验证注射靶位侧脑室定位准确后,行侧脑室微量注射给药。对照组给予PBS 0.5h;BSA-FITC组给予BSA-FITC 0.5h;T-BSA-FITC给予T-BSA-FITC 0.5h;F+T-BSA-FITC组预先给予Flu 0.5h,再给予T-BSA-FITC 0.5h。药物注射完毕后,各组小鼠断头取脑,冰上迅速分离海马组织。采用网搓法制备流式细胞术样本。采用流式细胞仪进行上机检测。对样本细胞进行流式荧光强度分析。实验三探究雄激素核受体抗体能否与SAMP8小鼠海马神经元细胞膜结合位点结合实验选用7月龄健康雄性SAMP8小鼠30只,随机分为胞膜完整组和胞膜透化组两大组。这两组又各自分为对照组,FITC-Ig G组和anti-AR Ab+FITC-Ig G组,每组小鼠各5只。各组小鼠断头取脑,冰上迅速分离海马组织。采用网搓法制备流式细胞术样本。胞膜透化各组加入固定液(2%多聚甲醛,0.1%Triton X-100)重悬细胞,冰浴0.5h后PBS漂洗。FITC-Ig G组用山羊抗小鼠FITC-Ig G抗体孵育;anti-AR Ab+FITC-Ig G组加入小鼠单克隆抗i AR抗体孵育,之后用山羊抗小鼠FITC-Ig G二抗孵育。采用流式细胞仪进行上机检测。对样本细胞进行流式荧光强度分析。结果1 SAMP8小鼠海马神经元细胞膜雄激素结合位点的定位T-BSA-FITC组荧光强度与对照组和BSA-FITC组相比明显增强,差异有统计学意义(P<0.01)。给予T-BSA-FITC 15min,流式细胞仪可检测到强荧光信号。给予T-BSA-FITC 0.5h和1.0h,荧光信号与给予T-BSA-FITC15min相比,没有明显的衰减或者增强(P>0.05)。但是,给予T-BSA-FITC2.0h,荧光信号较给予T-BSA-FITC 15min有明显的衰减(P<0.01)。为排除BSA与海马神经元胞膜相互作用对荧光强度的影响,测定给予BSA-FITC后的荧光情况。实验结果表明,与对照组相比,BSA-FITC没有增加细胞膜的荧光强度(P>0.05)。2雄激素受体拮抗剂氟他胺对雄激素与SAMP8小鼠海马神经元细胞膜结合位点结合的影响T-BSA-FITC组荧光强度与对照组和BSA-FITC组相比明显增强,差异有统计学意义(P<0.01)。预先给予氟他胺,再给予T-BSA-FITC组荧光强度与对照组和BSA-FITC组相比明显增强,差异有统计学意义(P<0.01)。但与单纯给予T-BSA-FITC组相比,荧光强度降低,差异有统计学意义(P<0.01)。3探究雄激素核受体抗体能否与SAMP8小鼠海马神经元细胞膜结合位点结合胞膜完整组海马神经元与雄激素核受体抗体孵育后,其荧光强度与对照组和单纯FITC标记二抗组相比无明显增加,差异无统计学意义(P>0.05)。胞膜透化组海马神经元与雄激素核受体抗体孵育后,其荧光强度与对照组和单纯FITC标记二抗组相比明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:1 SAMP8小鼠海马神经元存在细胞膜雄激素结合位点。2SAMP8小鼠海马神经元细胞膜雄激素结合位点与经典的i AR存在特征性差异。i AR抑制剂氟他胺未完全阻断雄激素T与细胞膜特异性结合位点的结合。3抗i AR抗体未能与海马神经元细胞膜结合位点相结合。第二部分细胞膜结合位点介导的雄激素对SAMP8小鼠海马神经元树突棘密度的影响目的:应用SAMP8小鼠为研究对象,观察去势及雄激素补充治疗对其海马神经元树突棘密度的影响。探讨不同剂量和不同时间的雄激素对突触形态可塑性影响的非基因组效应。方法实验一细胞膜结合位点介导的雄激素对SAMP8小鼠海马神经元树突棘密度影响的量效实验实验选用7月龄健康雄性SAMP8小鼠55只,随机分为假手术对照组(对照组)、去势组、去势+T补充治疗组(T组)、去势+T-BSA补充治疗组(T-BSA组)和去势+DHT补充治疗组(DHT组)。T组量效实验用浓度分别为25μg/5μl,50μg/5μl和100μg/5μl;T-BSA组量效实验用浓度分别为50μg/5μl,100μg/5μl和200μg/5μl;DHT组量效实验用浓度分别为15μg/5μl,30μg/5μl和60μg/5μl。对照组、去势组以及各激素补充治疗不同剂量组每组小鼠各5只。去势组、T组、T-BSA组和DHT组小鼠进行去势手术。SAMP8小鼠侧脑室立体定位与埋管,在验证注射靶位侧脑室定位准确后,行侧脑室微量注射给药。药物注射完毕2h后,常规经心脏灌注固定,开颅取脑,从上丘和视神经交叉处取脑组织。进行Golgi染色。1000×光镜下计数海马CAl区神经元顶树突第2或第3级树突棘的数目,计算每10μm顶树突树突棘的数目作为其树突棘密度。实验二细胞膜结合位点介导的雄激素对SAMP8小鼠海马神经元树突棘密度影响的时效实验实验选用7月龄健康雄性SAMP8小鼠60只,随机分为去势+T补充治疗组(T组)、去势+T-BSA补充治疗组(T-BSA组)和去势+DHT补充治疗组(DHT组)。根据参考文献以及预实验结果确定T组、T-BSA组和DHT组时效实验药物补充治疗时间分别为0.5h、1.0h、2.0h和4.0h。各激素补充治疗不同时间组每组小鼠各5只。各激素补充治疗浓度选定为量效实验中各激素对树突棘密度影响最显著的浓度。T组、T-BSA组和DHT组小鼠进行去势手术。SAMP8小鼠侧脑室立体定位与埋管,在验证注射靶位侧脑室定位准确后,行侧脑室微量注射给药。药物注射完毕2h后,常规经心脏灌注固定,开颅取脑,从上丘和视神经交叉处取脑组织。进行Golgi染色。1000×光镜下计数海马CAl区神经元顶树突第2或第3级树突棘的数目,计算每10μm顶树突树突棘的数目作为其树突棘密度。结果通过Golgi染色测定并计算细胞膜结合位点介导的不同剂量雄激素影响下SAMP8小鼠海马神经元顶树突第2或第3级树突棘的密度。去势组海马CA1区树突棘密度明显减少,差异有统计学意义(P<0.01)。在细胞膜结合位点介导的雄激素对SAMP8小鼠海马神经元树突棘密度影响的量效实验中,SAMP8小鼠去势后给予一定时间(2h)不同浓度的T、T-BSA和DHT,均可使去势小鼠海马神经元树突棘密度增加。其中,T组给予浓度为50μg/5μl时,T-BSA组给予浓度为100μg/5μl时,DHT组给予浓度为30μg/5μl时,树突棘密度增加较各雄激素其它给予浓度明显,差异有统计学意义(P<0.01)。在细胞膜结合位点介导的雄激素对SAMP8小鼠海马神经元树突棘密度影响的时效实验中,SAMP8小鼠去势后给予一定浓度,不同时间的T、T-BSA和DHT,均可使去势小鼠海马神经元树突棘密度增加。其中,给予50μg/5μl的T组2h,给予100μg/5μl的T-BSA组2h,给予30μg/5μl的DHT组4h时,树突棘密度增加较各雄激素其它给予时间明显,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:1 SAMP8小鼠去势后,雄激素缺乏导致海马CA1区神经元树突棘密度明显减少。2去势后雄激素补充治疗能快速增加SAMP8小鼠海马神经元树突棘密度,此作用主要是由海马神经元细胞膜雄激素结合位点介导的。第三部分细胞膜结合位点介导的雄激素对SAMP8小鼠海马神经元突触目的:应用SAMP8小鼠为研究对象,通过免疫组织化学染色方法和Western blot方法研究去势及雄激素补充治疗对其海马突触蛋白SNAP25、Syt1、SYN、PSD95、NR1和Drebrin表达的影响,为研究雄激素通过快速的非基因组效应影响突触可塑性提供依据,同时有助于了解雄激素发挥生理作用的方式。实验一免疫组织化学染色方法研究去势及去势后雄激素补充治疗对SAMP8小鼠海马突触蛋白SNAP25、Syt、SYN、PSD95、NR1和Drebrin表达的影响实验选用7月龄健康雄性SAMP8小鼠20只,随机分为假手术对照组(对照组)、去势组、去势+T补充治疗组(T组)和去势+DHT补充治疗组(DHT组)。根据第二部分实验结果确定T组给药浓度为50μg/5μl,给药时间为2h;DHT组组给药浓度为30μg/5μl,给药时间为2h。每组小鼠各5只。去势组、T组、T-BSA组和DHT组小鼠进行去势手术。SAMP8小鼠侧脑室立体定位与埋管,在验证注射靶位侧脑室定位准确后,行侧脑室微量注射给药。药物注射完毕2h后,常规经心脏灌注固定,开颅取脑,从上丘和视神经交叉处取脑组织。进行免疫组织化学染色。400×光镜下观察海马CA1区和CA3区SNAP25、Syt1、SYN、PSD95、NR1和Drebrin各蛋白的定位和表达情况。Image-Pro Plus 6.0图像分析软件测量图片的光密度。实验二Western blot方法研究去势及去势后雄激素补充治疗对SAMP8小鼠海马突触蛋白SNAP25、Syt1、SYN、PSD95、NR1和Drebrin表达的影响实验选用7月龄健康雄性SAMP8小鼠20只,随机分为假手术对照组(对照组)、去势组、去势+T补充治疗组(T组)和去势+DHT补充治疗组(DHT组)。根据第二部分实验结果确定T组给药浓度为50μg/5μl,给药时间为2h;DHT组组给药浓度为30μg/5μl,给药时间为2h。每组小鼠各5只。去势组、T组、T-BSA组和DHT组小鼠进行去势手术。SAMP8小鼠侧脑室立体定位与埋管,在验证注射靶位侧脑室定位准确后,行侧脑室微量注射给药。药物注射完毕2h后,提取海马组织蛋白,BCA法测定蛋白质浓度,对组织蛋白进行变性。SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳,切胶,漂洗及转膜后,进行免疫反应。Odyssey红外成像系统显影成像。以GAPDH的表达做为内参,测定各组突触蛋白相对表达水平。结果1免疫组织化学染色实验结果SNAP25、SYN、PSD95和Drebrin突触蛋白免疫反应产物呈棕黄色,主要位于海马CA1区和CA3区的神经毡区,呈现颗粒状或点状免疫标记,神经元胞体(Drebrin胞体着色)、胞核、胶质细胞及血管不被标记,海马以多形层和辐射层染色较深。Syt1和NR1突触蛋白免疫反应产物呈棕黄色,主要位于海马CA1区和CA3区分布在细胞膜和细胞质中,海马CA1区和CA3区的神经毡区也有免疫反应产物。对各组CA1区和CA3区突触蛋白SNAP25、Syt1、SYN、PSD95、NR1和Drebrin的OD值进行统计学分析后,发现与SAMP8小鼠假手术组相比,去势组CA1区和CA3区各突触蛋白的OD值均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。T组和DHT组CA1区和CA3区各突触蛋白的OD值较去势组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。2 Western blot实验结果对各组海马结构突触蛋白SNAP25、Syt1、SYN、PSD95、NR1和Drebrin的条带光密度的相对值进行统计学分析后,发现与SAMP8小鼠假手术组相比,去势组海马结构各突触蛋白条带光密度的相对值均明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)。T组和DHT组海马结构各突触蛋白条带光密度的相对值较去势组明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:1 SAMP8小鼠去势后,雄激素缺乏导致海马结构内突触蛋白SNAP25、Syt1、SYN、PSD95、NR1和Drebrin表达减少。2去势后雄激素补充治疗能快速增加SAMP8小鼠海马结构内突触蛋白SNAP25、Syt1、SYN、PSD95、NR1和Drebrin的表达。