【研究背景】脓毒症(sepsis)是指由严重感染、创伤、烧伤、术后感染及急危重病引起的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),并伴有危及生命的器官功能障碍,进一步可发展成为严重脓毒症、脓毒性休克及多器官功能障碍综合征(multiple organs dysfunction syndrome,MODS),甚至死亡。当下,由脓毒症引起的脓毒症休克和多器官功能障碍已成为重症监护病房(intensive care unit,ICU)的最常见死因之一。由于脓毒症的发病机制极其复杂,即便在转化医学高度发展的今天,临床治疗依然收效甚微,死亡率高居不下。因此,进一步探讨脓毒症的发生机制、寻找到新的预防、治疗手段已成为亟需解决的重要科学问题。急性胰腺炎(Acute Pancreatitis,AP)是一种由多种病因导致胰酶在胰腺内被激活后引起胰腺组织自身消化、水肿、出血甚至坏死的炎症反应,临床表现多样,变化范围可从经支持治疗后轻症自限性的疾病到高并发症和死亡率的威胁生命的疾病。脓毒症是继发重症胰腺损伤的重要原因,胰腺急性损伤后可引起炎症介质大量释放,加剧机体炎症反应及应激状态,使病情进一步恶化。尽管经大量临床及试验潜在治疗药物或手术处理,其中约10~20%病人死于多器官衰竭,这在一定程度上由于治疗AP可供选择的药理学选择缺乏。研究显示胰酶的活化、炎症、氧化应激及核因子NF-κB是AP的重要病理生理组成。一氧化碳(Carbonmonoxide,CO)作为继一氧化氮以后发现的第二种重要的气体第二信使分子,其具有舒张血管和支气管平滑肌、抑制血小板聚集、抑制炎症反应、抗凋亡、抗增殖等多种生理学作用,在神经、呼吸、循环等生理过程和抑制急性炎性反应、脏器缺血再灌注损伤、器官移植排斥反应等病理过程中发挥着重要调节作用。一氧化碳释放分子(CO-releasing molecules,CORM-2)是一类新合成的可以释放一氧化碳气体的过渡金属化合物,其可释放一氧化碳所以受到越来越多的关注并可能发展其药用。已有研究结果显示CORM-2释放的CO可以显著的改善盲肠结扎并穿孔(CLP)小鼠以及LPS刺激小鼠的炎症反应,有效保护小鼠重要脏器减少损伤,改善机体缺血再灌注,提高实验小鼠的生存率。然而,关于一氧化碳释放分子在改善炎性反应,减少胰腺损伤的保护机制方面,即细胞信号通路问题上的研究,目前尚未有报道。基于此,本研究主要是分析了一氧化碳在脓毒症小鼠模型和重症胰腺炎小鼠模型所致胰腺损伤的保护作用,并探讨了NF-κB细胞通路在这种保护作用中所起到的分子机制。【研究方法】研究CORM-2对CLP模型小鼠胰腺的保护作用。清洁级健康雄性C57BL/6小鼠68只(其中48只用于生存率分析,20只其他实验)随机分成4组:假手术组(Sham)组,CLP组,CLP+CORM-2组及CLP+iCORM-2组,假手术组或CLP后即开始计,分别记录各组72h生存率,于1、2、4、6、8、10、12、16、20、24、36h测定各组小鼠血糖水平,并且在第6小时、12小时及24小时对小鼠进行异氟烷麻醉下心脏穿刺采血,最后取胰腺组织于液氮中冻存或用10%福尔马林固定,用于后续实验。利用全自动生化分析仪检测检测血清淀粉酶、脂肪酶的水平,取胰腺组织HE染色并进行病理学评分,检测过氧化物酶(MPO)活力。C57BL/6小鼠腹腔注射雨蛙素(50μg/kg)每小时一次,共10次,建立ANP小鼠模型;将模型小鼠分组为对照组(Control组),急性出血坏死性胰腺炎(ANP组),CORM-2干预组(AP+CORM-2组),iCORM-2干预组(AP+iCORM-2组)。CORM-2或iCORM-2于第一次注射雨蛙素30min后,各组均于第一次雨蛙素注射12小时后收集小鼠血液及胰腺组织。运用全自动生化仪检测血清中淀粉酶、脂肪酶、AST、ALT的水平,对胰腺组织进行HE染色,TUNEL法检测胰腺组织凋亡,称重法检测胰腺组织湿干比,分光光度计检测胰腺组织中MPO(髓过氧化物酶)的活性,使用酶标仪对胰腺组织中MDA(丙二醛)进行检测。采用ELISA法检测重症胰腺炎模型小鼠血浆及胰腺组织中细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)水平,免疫组化的方法检测胰腺组织中ICAM-1及VCAM-1的表达情况,运用Western blot方法对NF-κB、P-IκBα的水平进行检测。【研究结果】(1)CORM-2的干预对可改善CLP模型的生存率,对于血糖影响不明显。与Sham小鼠相比,CLP术后血清淀粉酶水平在6 h即开始升高,在CLP术后24 h后增加更为明显。在CLP术后6 h、12h和24 h,CORM-2的干预均能显著降低了血清淀粉酶的水平。与CLP组相比,使用iCORM-2治疗的脓毒症小鼠的血清淀粉酶活性没有改变。在血清脂肪酶水平上也有类似的结果;通过对各组小鼠胰腺组织HE染色结果显示:Sham组小鼠的胰腺显示正常的结构,而脓毒症小鼠的胰腺组织在CLP术24h表现出严重的病理损伤。脓毒症小鼠的胰腺组织具有典型的水肿、炎性细胞浸润和腺泡细胞坏死。在CORM-2干预后,显著降低了胰腺损伤的组织学损伤的程度,而在iCORM-2治疗组中没有发现胰腺损伤的减轻。MPO活性检测的结果显示:与假手术组相比,CLP术后6 h、12 h和24h,小鼠胰腺组织MPO活性明显增加,并在24 h时更加明显。CORM-2的治疗可明显减弱MPO活性,CORM-2的治疗降低了胰腺组织中性粒细胞的浸润。CLP组与CLP+iCORM-2组之间无显著性差异。上述结果提示在脓毒症时,胰腺组织亦是易受损害的器官之一,CORM-2干预对这一损害有一定的保护作用,而胰腺组织病理学评分的定量分析说明与CLP组相比,CORM-2治疗在CLP诱导的胰腺损伤中发挥了保护作用。(2)通过雨蛙素连续腹腔注射成功建立急性出血坏死性胰腺炎小鼠模型。CORM-2能够明显降低雨蛙素诱导的ANP小鼠血清淀粉酶、脂肪酶水平,减轻腺泡细胞的凋亡(TUNEL),减轻胰腺组织损伤;CORM-2能够明显的提高雨蛙素诱导的ANP小鼠生存率。以上结果提示,CORM-2可明显的保护急性出血性坏死性胰腺炎小鼠的脏器功能,提高小鼠生存率。(3)与假手术组相比,脓毒症小鼠胰腺组织促炎细胞因子IL-6,IL-1β及TNF-α显著增加,CORM-2干预,胰腺组织IL-6、IL-1β和TNF-α的表达减少,然而,iCORM-2治疗不施加任何影响这些细胞因子的表达。脓毒症小鼠NF-κB p65及磷酸化的-IκB-α(p-IκB-α)表达水平明显升高,而CORM-2干预则抑制了其表达,而iCORM-2干预对此无改变。CORM-2能够明显降低雨蛙素诱导的ANP小鼠减轻血清及胰腺组织细胞因子水平(TNF-α、IL-1β、IL-6)的表达,CORM-2能够明显的抑制雨蛙素诱导的ANP小鼠胰腺组织NF-κB p65及磷酸化的-IκB-α(p-IκB-α)表达水平,抑制因NF-κB活化、表达所导致的炎症反应、氧化应激产物增多。综上,本研究采用小鼠脓毒症模型和急性胰腺炎的胰腺损伤模型,对胰腺炎症反应进行了系统的研究,并使用CORM-2进行干预,提示了CORM-2通过抑制NF-κB信号通路的活化来抑制机体的炎症反应,从而对脓毒症和胰腺炎时胰腺组织的损伤起保护作用。【研究结论】本研究发现,脓毒症时,小鼠胰腺组织血管内皮细胞表面附着的ICAM-1、VCAM-1明显增多,蛋白NF-κB的表达量也明显增多,CORM-2干预可以明显的抑制上述炎症指标,这种保护作用是通过NF-κB细胞信号通路而发生作用的。