杜仲胶合成相关基因EuREF1克隆及表达分析

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本研究以杜仲(Eucommia ulmoides Oliv.)7月雌株嫩叶与新生幼枝为材料,根据杜仲转录组库的片段注释信息,采用5’-末端转录转换cDNA末端快速扩增技术(Switching Mechanism At5’-end of the RNA Transcript Rapid Amplification of cDNA Ends,SMART RACE)从杜仲中成功克隆了编码杜仲橡胶延长因子(rubber elongation factor,REF)的全长cDNA序列,该序列命名为EuREF1。分别构建了EuREF1基因的原核表达系统(pGEX-GST-EuREF1)和植物表达系统(pSH-35S-EuREF1),研究了EuREF1基因的表达情况。本研究获得的结果如下:  1、EuREF1的cDNA序列全长1075bp,开放阅读框678bp,编码225个氨基酸。生物信息学分析显示:EuREF1蛋白分子量约为24.9768 kDa,理论等电点pI为6.32;氨基酸组成中以丙氨酸(11.1%)、缬氨酸(11.1%)、亮氨酸(8.4%)含量为最高,蛋白不稳定系数为30.63,属于稳定蛋白质。预测EuREF1蛋白二级结构中α-螺旋占66.67%,β-折叠占4.89%,螺环结构占28.44%,未发现信号肽,发现跨膜结构。NCBI进行EuREF1核酸序列blastn比对,结果显示同源性最高的是鹰嘴豆(76%,Cicer arietinum XM_004502239.1)和梅花(69%,Prunus mume XM_008223935.1)的REF核酸序列;NCBI进行EuREF1氨基酸序列blastp比对,结果显示同源性最高的是葡萄(42%,Vitis vinifera XP_002278036.1)和蓖麻(41%,Ricinus communis XP_002514917.1)的REF蛋白序列。保守结构域分析认为EuREF1具有与橡胶延长因子一致的区域。分析NCBI中已报道的所有REF蛋白序列,选取已报道的每个种属中具有代表性的、氨基酸序列完整的一个序列作为数据源,以此构建系统发育树结果显示杜仲EuREF1在进化历程上与绝大多数植物的REF亲缘性较远,与之最近的为三叶橡胶REF。  2、在初始载体pGEX-6p-1的基础上,构建了EuREF1基因的原核表达系统(pGEX-GST-EuREF1)并转化大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)。使用1mmol·L-1 IPTG诱导目的蛋白表达,进行SDS-PAGE检测,产生了约为45kDa的蛋白,与预测的GST::EuREF1融合蛋白相对分子量大小相近。说明EuREF1蛋白能在大肠杆菌中诱导表达,含有pGEX-GST-EuREF1的大肠杆菌表达菌株BL21可用于生产EuREF1蛋白。  3、在初始载体pSH737的基础上,构建了EuREF1基因的双子叶植物表达系统(pSH-35S-EuREF1),并使用农杆菌介导法遗传转化普通烟草(Nicotiana. tabacum L.)品种长脖黄,对获得的抗性植株进行GUS组织化学染色和基因组PCR检测,证明了EuREF1基因已整合进入转基因烟草的基因组中,获得了含EuREF1基因的转基因烟草植株43株。经鉴定确定为EuREF1转基因烟草植株幼苗与野生型烟草植株幼苗同时移栽至温室大棚,花盆培养四个月之后,统计野生型、对照组与转EuREF1基因叶片的长宽比,发现转基因烟草叶片比野生型烟草叶片更为狭长。
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