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转基因克隆山羊在医药、畜牧业和生物材料等领域具有广泛的应用前景。虽然制备转基因克隆动物的方法很多,但体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer,SCNT)方法由于可以在细胞水平上进行基因修饰和阳性细胞筛选,是目前最常用的一种方法。近年来,本实验室采用SCNT方法获得了批量转人乳铁蛋白(human lactoferrin,hLF)基因的克隆山羊,但总体效率仍然不高。转基因克隆胎儿在附植期或围产期容易发生流产,部分活产的克隆动物也表现出发育异常而导致存活率低。目前普遍认为,转基因克隆效率低下主要是由于供体细胞核不能被卵胞质完全重编程所致。因此,本研究拟由表观重编程入手,从印记基因、DNA甲基化结合蛋白以及组蛋白去乙酰化酶等多个角度研究和分析引起转基因克隆山羊发育异常的原因,为提高转基因克隆效率提供理论参考。1.转基因克隆山羊肺脏组织中发育相关基因表达的研究新生死亡的转基因克隆山羊多表现出肺脏发育异常。因此,本试验采用HE染色法对流产及出生后死亡的转基因克隆山羊的肺脏组织进行了病理分析,并通过荧光定量PCR检测了15个发育相关基因的表达情况。结果表明,流产及新生死亡的转基因克隆山羊的肺脏组织出现了广泛的炎症细胞浸润。与对照组Ⅰ(自然繁殖的1日龄奶山羊)肺脏组织相比,死亡组Ⅰ(出生3日龄内死亡的转hLF基因山羊)肺脏组织中BMP4、FGF10、GHR、HGFR、PDGFR、RABP、VEGF、H19、CDKNIC、PCAF、MeCP2、HDAC1和Dnmt3b等13个基因的表达量显著降低(P<0.05);流产组肺脏组织中的FGF10、PDGFR、RABP、VEGF、PCAF、HDAC1、MeCP2和Dnmt3b等8个基因显著降低(P<0.05)。与对照组Ⅱ(自然交配产生1月龄、2月龄和5月龄的奶山羊)肺脏组织相比,死亡组Ⅱ(出生后26日龄、61日龄和145日龄死亡的转hLF基因山羊)肺脏组织中PCAF和Dnmt3b基因的表达量显著降低(P<0.05)。综上所述,流产及出生后死亡的转基因克隆山羊均出现肺脏病理变化,并伴随有发育相关基因的表达异常,反映了表观遗传修饰的改变可能与转基因克隆山羊肺脏组织的发育异常密切相关。2.转基因克隆山羊心、肝、脾和肾脏组织中印记基因表达的研究本试验以流产组以及新生死亡组转基因克隆山羊为对象,通过HE染色观察了其心、肝、脾和肾脏组织的形态结构变化,并采用荧光定量PCR方法检测了8个印记基因在这些组织中的相对表达量,分析印记基因对转基因克隆山羊发育异常的影响。结果表明,流产组心脏和脾脏组织形态结构未发生明显的变化,肝脏组织有炎症细胞浸润,肾脏呈现肾小球肾炎的组织形态特征;死亡组肝脏组织出现炎症细胞,心、脾和肾脏组织未出现明显的结构变化。同时,与对照组相比,在心脏组织中,流产组CDKN1C、H19、IGF2R和SNRPN等基因的表达水平显著升高(P<0.05),XIST基因的表达水平显著降低(P<0.05),死亡组SNRPN和XIST基因的表达水平显著降低(P<0.05);在肝脏组织中,流产组CDKN1C和DLK1基因的表达水平显著降低(P<0.05),GNAS、H19、IGF2R、PEG3和XIST等基因的表达水平显著升高(P<0.05),死亡组CDKN1C基因的表达水平显著降低(P<0.05),GNAS和PEG3基因的表达显著升高(P<0.05);在脾脏组织中,流产组DLK1基因的表达水平显著升高(P<0.05),GNAS、H19、IGF2R、PEG3、SNRPN和XIST等基因的表达水平显著降低(P<0.05),死亡组DLK1,H19,IGF2R,PEG3,SNRPN和XIST等基因的表达水平显著降低(P<0.05);在肾脏组织中,流产组CDKN1C、DLK1、GNAS、IGF2R和PEG3等基因的表达水平显著升高(P<0.05),H19和XIST基因的表达水平显著降低(P<0.05);死亡组PEG3基因的表达水平显著降低(P<0.05)。以上结果表明,在流产及新生死亡的转基因克隆山羊心、肝、脾和肾脏组织中存在异常的基因组印记;流产组印记基因表达的异常程度显著高于死亡组。提示:印记基因的表达异常可能会引起转基克隆山羊发育缺陷,同时暗示了转基因克隆山羊的供体细胞在重编程过程中存在异常的表观遗传修饰。3.转基因克隆山羊胚胎、胎盘和内脏组织中DNA甲基化结合蛋白表达的研究本试验通过荧光定量PCR和免疫组织化学的方法,分析了MBD1和MeCP2在转基因克隆山羊的胚胎、胎盘、心、肝、脾、肾、胃和肠道组织中基因的表达和蛋白定位。结果表明,与对照组胚胎(自然交配产生的体内受精卵,n=20/时期)相应发育阶段(1-细胞期、2-4细胞期、8-16细胞期、桑椹胚期以及嚢胚期)相比,MBD1基因在转基因克隆山羊胚胎发育的2-4、8-16细胞期的表达水平显著升高(P<0.05),而在桑椹胚和囊胚阶段,其表达水平显著降低(P<0.05);MeCP2基因的表达水平在转基因克隆山羊胚胎发育的2-4细胞期显著降低(P<0.05),在8-16细胞期显著升高(P<0.05)。对转基因克隆山羊胎盘组织形态学分析发现,死亡组胎盘子叶数显著低于对照组和存活组(P<0.05)。同时免疫组化分析显示MBD1和MeCP2蛋白在各组山羊的胎盘滋养层双核细胞以及胃肠道黏膜上皮细胞中均有明显的表达。MBD1和MeCP2基因在死亡组胎盘子叶中的表达水平显著高于对照组和存活组(P<0.05)。此外,与对照组相比,MBD1基因在死亡组心脏、肝脏中的表达水平显著提高(P<0.05);MeCP2基因在死亡组肝脏、脾脏、瘤胃、皱胃、小肠、结肠和直肠中的表达水平显著降低(P<0.05)。以上结果初步表明,在转基因克隆山羊胚胎发育的多个阶段以及多个组织器官中,曱基化CpG结合蛋白MBD1和MeCP2均出现不同程度异常表达,说明转基因克隆山羊发育过程中MBD1和MeCP2参与的转录调控和DNA甲基化的异常可能与转基因克隆山羊发育异常有关。4.转基因克隆山羊胚胎、胎盘和内脏组织中组蛋白去乙酰化酶表达的研究本试验通过荧光定量PCR和免疫组织化学的方法,检测HDAC1、HDAC2和HDAC3在转基因克隆山羊的胚胎、胎盘和内脏组织中的基因表达和蛋白定位,分析组蛋白去乙酰化酶对转基因克隆山羊胚胎发育以及组织器官功能的影响。结果表明,与体内受精卵相对应的各个发育阶段相比,HDAC1和HDAC3基因在转基因克隆山羊胚胎发育的2-细胞期、桑椹胚和囊胚阶段的表达水平显著降低(P<0.05),8-16细胞期表达水平显著升高(P<0.05)。免疫组化分析发现,HDAC1、HDAC2和HDAC3蛋白在转基因克隆山羊胎盘滋养层上皮细胞以及胃肠道黏膜上皮细胞均有表达。荧光定量结果显示,HDAC1和HDAC3基因在死亡组胎盘子叶中的表达水平显著高于对照组和存活组(P<0.05)。此外,与对照组相比,HDAC1基因在转基因克隆山羊心脏组织中的表达水平显著升高(P<0.05),在肝脏、脾脏、瘤胃、网胃、瓣胃、十二指肠、空肠和结肠组织中表达水平显著下降(P<0.05);HDAC2基因在心脏和盲肠组织中的表达水平显著升高(P<0.05),在肝脏、脾脏、网胃、瓣胃、十二指肠和结肠组织中表达水平显著下降(P<0.05);HDAC3基因在心脏、肝脏、脾脏、瘤胃、瓣胃、十二指肠、空肠、结肠和直肠组织中表达水平显著下降(P<0.05),在网胃和盲肠组织中表达水平显著升高(P<0.05)。以上结果表明,在转基因克隆山羊整个发育过程中,组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC3都存在异常的表达,而这种异常可能会引起转基克隆山羊胚胎以及组织器官发育异常。