研究背景神经病理性疼痛具有普遍性,且伴发疾病多样,不仅使患者出现睡眠障碍、无力等,甚至会产生焦虑、抑郁等精神障碍共病现象。特别是异常的精神障碍可能会导致疼痛持续时间和强度的延长,并在疼痛和情绪厌恶之间形成恶性循环。尽管镇痛药和抗抑郁类药物多种多样,然而遗憾的是,由于神经病理性痛诱发负性情绪共病的发病机制仍未阐明,因此治疗还没有根本性突破,开发一种新的、有效的治疗神经性疼痛与精神障碍共病的治疗方案仍然是一项重大挑战。前扣带回皮层（Anterior cingulate cortex,ACC）的细胞可塑性被认为是疼痛感知和情绪的关键接口。但迄今为止,越来越多的关注点集中在细胞内的可塑性机制上,而细胞外的变化长期被忽视。细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）在中枢神经系统（Central nervous system,CNS）中与突触可塑性和各种病理生理过程的调节密切相关。层粘连蛋白（Laminins）作为ECM的关键组成部分,其是由α亚基、β亚基和γ亚基构成的异三聚体糖蛋白家族,参与多种病理生理过程。我们发现ACC中的Lamininβ1（Lamb1）在外周神经损伤并伴发焦虑及抑郁样行为后显著下调。那么,Lamb1是否以及如何参与神经性疼痛与精神障碍共病,其潜在的细胞外-细胞内的相互作用机制,目前仍不清楚。实验目的1.研究ACC脑区Lamb1在小鼠神经病理性痛与精神障碍共病中的作用及影响;2.深入探讨Lamb1对ACC突触可塑性以及相关分子机制的调控作用;3.探究通过药物干预Lamb1的表达变化对神经病理性痛与精神障碍共病的作用。实验方法1.ACC中Lamb1在神经病理性疼痛伴发焦虑抑郁等精神障碍行为中的变化与表达谱。对小鼠进行单侧选择性神经损伤模型（Spared nerve injury,SNI）手术,利用von Frey纤维丝和热辐射方法检测不同时间点小鼠的疼痛阈值变化。同时利用旷场（Open field test,OFT）,高架十字迷宫（Elevated plus maze,EPM）,悬尾（Tail suspension test,TST）和糖水偏好（Sucrose preference test,SPT）这些行为范式检测慢性痛对焦虑及抑郁样行为的影响。采用RNA测序法、荧光定量PCR（q PCR）和Western blot检测慢性痛伴发焦虑及抑郁样行为小鼠ACC脑区转录组变化,并进一步明确Lamb1的表达变化。利用免疫荧光染色法,观察ACC脑区Lamb1的表达谱分布。2.ACC脑区中Lamb1下调对疼痛和伴发焦虑及抑郁样行为的影响。构建Lamb1干扰病毒,利用q PCR、Western blot和免疫荧光染色法筛选并验证其干扰效率。对SNI诱发慢性痛和焦虑抑郁样小鼠进行对侧ACC脑区定位注射Lamb1干扰病毒后,进行机械痛和热痛阈值检测,EPM、TST和SPT进行焦虑及抑郁样行为检测,观察ACC脑区Lamb1外源抑制对其行为的影响。3.Lamb1对ACC脑区突触结构和功能可塑性的影响。对SNI手术56天并对侧注射Lamb1干扰病毒的小鼠ACC脑区进行高尔基染色,利用Imaris软件进行Sholl分析,观察树突复杂性变化;进一步对树突棘进行密度和分类分析。对野生型小鼠右侧ACC注射Lamb1干扰病毒后,利用全细胞膜片钳方法进行神经元兴奋性、突触传递及其机制分析。4.Lamb1调控小鼠慢性疼痛和伴发焦虑及抑郁样行为的潜在机制。对病毒感染ACC脑区和皮层原代培养神经元进行鬼笔环肽染色,观察F-actin和突触后膜蛋白PSD95变化;利用免疫共沉淀（Co-IP）、Pulldown和Western blot检测Lamb1与整合素β1（Integrinβ1,Itgβ1）的相互作用,以及Lamb1对Src/Rho A/LIMK/cofilin信号通路的影响;利用核膜分离和Western blot方法进一步检测Lamb1对质膜中AMPA受体、NMDA受体和PSD95的影响;利用光纤钙成像方法,分析ACC右侧脑区注射Lamb1干扰病毒和Ca MKII-GCa MP6s病毒对小鼠TST过程中锥体神经元钙活动的影响。5.Lamb1-Integrinβ1通路的激活对神经病理性痛和伴发焦虑抑郁样行为的作用及机制。利用置管给药方法,对SNI小鼠ACC双侧脑区进行单次定量给予Integrinβ1激动剂Pyrintegrin后,进行机械刺激和热刺激检测疼痛阈值变化,EPM、TST和SPT进行小鼠焦虑及抑郁样行为检测。利用Western blot和细胞鬼笔环肽染色法观察Pyrintegrin对其行为影响的潜在分子机制。6.其他抑郁模型及性别差异对ACC脑区中Lamb1表达的影响。利用慢性束缚应激模型（CRS）和口服皮质酮（CORT）方法建立抑郁模型后,采用Western blot检测Lamb1变化;对雌鼠进行单侧SNI手术,利用Western blot检测Lamb1变化。实验结果及讨论1.通过对模型小鼠分别在术后3 d,7 d,14 d,28 d和56 d进行机械痛阈和热痛阈检测,发现小鼠在术后第7天出现显著的机械性和热痛敏现象,且持续稳定存在于整个检测周期。同时,在术后28 d,小鼠出现焦虑样行为。而在术后56 d后,小鼠出现焦虑及抑郁样行为,提示SNI小鼠在持续痛觉敏化情况下,出现精神障碍共病现象。利用RNA测序技术,我们检测到SNI后56 d,ACC脑区共有565个差异表达基因,且与ECM受体相互作用和黏着斑相关通路密切相关。在ECM相关通路中,Lamb1在ACC中表现出显著的转录下调,并在m RNA和蛋白水平上都得到了验证。进一步通过免疫荧光染色分析,发现Lamb1主要在ACC脑区锥体神经元中表达。2.ACC脑区外源敲低Lamb1后,发现Sham组和SNI小鼠同侧和对侧足底机械性痛阈均显著降低,提示ACC脑区Lamb1下调诱致和加剧了小鼠机械性痛敏现象。进一步通过焦虑及抑郁样行为范式检测发现ACC脑区Lamb1敲低导致Sham组小鼠呈现焦虑抑郁样行为。3.高尔基染色结果发现,下调Lamb1会导致ACC锥体神经元顶树突发生明显的树突棘重塑,表现为树突棘密度增加和其形态改变,主要为成熟的有功能的短粗型Stubby和蘑菇型Mushroom显著增多。进一步电生理分析显示,敲低Lamb1会促使ACC锥体神经元呈现超兴奋状态,表现为去极化注入电流刺激诱发的放电频率增加和Rheobase降低。同时,AMPARs介导的突触传递在Lamb1沉默后显著增强。进一步的机制分析表明,Lamb1的上述突触调控均与突触前和突触后机制有关。4.体外和体内鬼笔环肽染色均显示,Lamb1下调后神经元中F-actin聚合显著增加,表明Lamb1缺失导致树突棘肌动蛋白组织异常。通过Co-IP实验发现,Lamb1与Integrinβ1在ACC中存在相互作用,Lamb1的下调大大削弱了这种相互作用,证实了Lamb1与Integrinβ1具有潜在的调控关系。通过进一步检测Lamb1-Integrinβ1下游信号的级联反应,我们发现ACC中Lamb1干预导致Src激酶的磷酸化水平显著降低,进而减少GAP蛋白的酪氨酸磷酸化水平,从而增加GTP-Rho A水平,ROCK2得到增强,进一步激活LIMK2,并通过增加cofilin的磷酸化使其失活。因此,Lamb1敲低诱导的cofilin活性抑制将导致异常的肌动蛋白重排,触发突触重塑。另一方面,小鼠ACC中Lamb1敲低的质膜中Glu R1数量增加,PSD95也显著上调。通过光纤钙成像实验发现,在Lamb1基因敲减小鼠的悬尾实验中,ACC中表达GCa MP6s的锥体神经元活性升高。5.通过对SNI诱发痛觉敏化和负性情绪共病小鼠ACC脑区定位给予Integrinβ1激动剂Pyrintegrin后,不仅能够显著缓解机械刺激和热辐射刺激导致的痛觉敏化,同时减轻了慢性痛伴发的焦虑及抑郁样行为的产生。进一步对给药后的ACC脑区进行蛋白表达检测,发现Pyrintegrin可能通过阻断Src磷酸化水平下降,进而降低cofilin磷酸化水平,保持其活性,细胞水平验证了Pyrintegrin抑制Lamb1下调导致的Factin聚合现象。6.CORT和CRS抑郁模型ACC脑区的Lamb1没有发生著改变。通过进一步验证Lamb1在慢性痛伴发焦虑及抑郁样行为的雌性小鼠ACC脑区变化,发现与雄性小鼠结果一致。结论1.在建立慢性痛伴发焦虑及抑郁样行为后,初步发现ACC脑区中Lamb1发生显著下调且主要分布于锥体神经元,提示ACC中Lamb1在神经病理性痛与精神障碍共病中发挥潜在作用。2.通过病毒感染方法外源敲低ACC中Lamb1水平,能够加剧疼痛敏感性,诱发焦虑和抑郁样行为,提示ACC中Lamb1表达水平变化与小鼠痛觉敏化和伴发的焦虑抑郁样行为密切相关。3.Lamb1下调导致ACC锥体神经元顶树突发生显著的树突棘密度增加和其形态改变,并使神经元进入超兴奋状态,AMPARs介导的突触传递显著增强,其可能与突触前和突触后机制有关。表明病理条件下Lamb1功能的丧失可导致ACC锥体神经元的突触结构和功能可塑性异常。4.Lamb1通过Src/Rho A/LIMK/cofilin信号通路参与Integrinβ1依赖的F-actin细胞骨架调控,进一步导致突触重塑和AMPARs突触运输,从而增强突触功能这一新机制。5.Integrinβ1激动剂Pyrintegrin可能通过阻断Src/cofilin信号通路缓解Lamb1下调导致的F-actin聚合现象,从而显著缓解痛觉敏化和伴发的焦虑及抑郁样行为。因此,进一步证实了Lamb1-Integrinβ1对突触可塑性的分子调控机制,为阐明Lamb1作为ECM在神经病理性疼痛与精神障碍共病中的作用提供了重要的理论依据和潜在的治疗靶点。6.ACC中的Lamb1可能与无疼痛的抑郁症无关,同时在调控疼痛伴发负性情绪过程中没有性别差异。