程序性死亡配体1（PD-L1）是具有负性免疫调节作用的B7家族成员,与表达在T细胞表面的程序性死亡受体-1（PD-1）结合发挥抑制肿瘤免疫及促进肿瘤进展的作用。针对PD-1/PD-L1的单抗药物在临床治疗中虽取得明显疗效,依然存在响应率低、缺少特异的分子检测标志物等问题。为此,本研究拟通过噬菌体展示技术制备结合PD-L1的新型纳米抗体制剂,并分析其在原核和真核表达中的抗原结合活性、特异性及储存稳定性,为今后构建双特异抗体和作为体内分子显像示踪剂提供实验基础和材料。本研究主要包含以下三部分内容:1.骆驼VHH噬菌体免疫文库的构建采用h PD-L1蛋白免疫骆驼五次后抗体滴度达到1:64000。采取免疫骆驼外周血并分离淋巴细胞提取总RNA和反转录为c DNA。以c DNA为模板,PCR获得重链可变区（VHH）基因片段,与p MECS载体连接并电转化至TG1感受态细胞,获得库容量为1.3×10⁸cfu纳米抗体噬菌体展示文库,菌落PCR检测阳性插入率为97%。2.PD-L1纳米抗体的筛选及原核表达分析文库筛选采用固相ELISA亲和淘洗,重组人PD-L1蛋白包被ELISA板并加入辅助噬菌体感染的文库进行三轮结合、淘洗、洗脱和扩增。单克隆胞间质可溶性ELISA对洗脱的克隆进行检测鉴定及序列测定分析,获得与PD-L1蛋白特异性结合OD₄₅₀值最高和重复次数最多的克隆VHH-F2G4-1和VHH-F3A6,在大肠杆菌中进行表达纯化,获得纯度在85%以上,大小在18 k Da的纳米抗体。间接ELISA分析纯化的纳米抗体与PD-L1重组蛋白的结合表明,两株纳米抗体与h PD-L1具有较高结合亲和力,在同等浓度下（1μg/m L）与PD-L1商品单抗结合力相当,同时与无关对照抗原均不结合,显示较高的结合特异性。流式细胞术检测纳米抗体与细胞表面PD-L1的结合结果表明,较高浓度（20μg/m L）下,F2G4-1和F3A6与细胞表面PD-L1具有结合能力,其中F2G4-1结合活性较高。3.PD-L1纳米抗体的真核表达及性质分析为明确真核表达的纳米抗体是否具有更高的细胞表面抗原结合活性,选择PD-L1纳米抗体VHH-F2G4-1与人Fc片段融合,构建至真核表达载体p KN055,并转染HEK293细胞进行表达纯化获得纯度在85%以上的F2G4-1-Fc纳米抗体。在ELISA检测中,真核表达的F2G4-1-Fc抗体与重组h PD-L1在低浓度下（1.5nmol/m L）具有明显结合活性,同时与无关对照抗原均不结合,具有很高的抗原结合活性及特异性。FACS检测表明:F2G4-1-Fc在较低浓度下（6.6 nmol/m L）与细胞表面的PD-L1具有明显的结合活性,而与不表达PD-L1的细胞不具有结合活性。此外F2G4-1-Fc放置稳定性实验ELISA结果表明:F2G4-1-Fc在含或不含5%FBS的PBS中37℃放置14天后,其结合活性与放置前相比无显著差异,常温储存稳定性强。总结以上结果,通过噬菌体展示技术从文库中筛选获得了具有较高亲和力和特异性的PD-L1纳米抗体。该抗体可以在原核和真核细胞中获得可溶性表达,两种体系表达的纳米抗体对重组蛋白具有一定的结合活性,真核表达的抗体与细胞表面抗原结合活性较高,提示纳米抗体的活性与其在细胞内形成正确的折叠形式具有密切关系。本研究获得PD-L1纳米抗体至少在体内外PD-L1表达的分子检测方面具有一定应用前景。