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随着世界人口老龄化问题的加剧,脑老化以及神经退行性疾病带给人们的威胁越来越大。美国Marist民意调查机构在1247名成年人对于衰老的调查显示,比起容颜消逝以及其它疾病,82%的民众认为衰老相关的认知功能损伤对他们来说是衰老带来的最大恐惧。衰老相关的认知功能损伤确实严重降低了老年人的生活质量和自主生活能力,并且给家庭和社会带来了巨大的看护压力和经济负担,所以研究衰老相关的认知功能损伤机制并寻找应对策略有重大意义。一氧化氮(Nitric Oxide,NO)作为神经递质在认知功能调控包括神经元的突触可塑性中发挥着非常关键的作用。亚硝基化谷胱甘肽还原酶GSNOR(S-NitrosoglutathioneReductase)是体内NO的关键代谢酶,它可以通过代谢GSNO来调控体内NO平衡和关键蛋白质的巯基亚硝基化修饰。因此我们推测GSNOR可能在衰老相关的认知功能损伤中发挥作用。本论文主要集中于GSNOR在衰老相关的认知功能损伤中的作用和机制研究。主要研究结果如下: (1) GSNOR在衰老小鼠海马组织中高表达。我们检测了自然衰老小鼠(22个月)的海马组织样品,发现与成年期(7个月)对照样品相比,GSNOR的表达水平明显增加。同时,我们通过生物信息学方法检索发现加速衰老小鼠模型SAMP8海马组织中GSNOR的转录水平显著高于对照SAMR1小鼠;衰老女性组的皮层中GSNOR转录水平明显高于年轻女性组;伴随认知功能损伤的唐氏综合征病人和阿尔兹海默症病人脑中GSNOR转录水平显著增加。 (2)神经元特异性高表达GSNOR的转基因小鼠学习记忆缺陷,敲除GSNOR可以挽回衰老相关的认知功能损伤。 为了模拟衰老小鼠脑中GSNOR高表达的现象,我们利用Thy1.2启动子构建了神经元特异性高表达GSNOR的转基因小鼠,通过分析发现GSNOR转基因小鼠基本表型与同窝野生型小鼠没有显著性差异。接下来,我们利用Morris水迷宫,恐惧箱和Y形迷宫三种海马依赖的学习记忆行为学检测了转基因小鼠的学习记忆能力,证明神经元特异性高表达GSNOR的转基因小鼠空间学习记忆能力缺陷。接下来,我们通过Y迷宫和恐惧箱的行为学实验证实自然衰老的GSNOR敲除小鼠(22个月)的空间学习记忆能力显著强于同窝杂合和野生型小鼠,证明衰老相关的认知功能损伤依赖于GSNOR的高表达。 (3) GSNOR转基因小鼠海马脑片的长时程增强能力损伤,海马CA1区锥体神经元树突棘密度降低。 电生理实验结果证明GSNOR转基因小鼠海马脑片的突触基本功能和突触前功能与野生型相比基本没有变化,但是高频刺激诱导的长时程增强能力明显损伤。同时,我们通过将GSNOR转基因小鼠与绿色荧光蛋白GFP转基因小鼠交配,得到带有GFP标记的GSNOR转基因小鼠并对其神经元树突棘密度进行检测。结果显示GSNOR转基因小鼠海马组织CA1区锥体神经元的树突棘密度明显低于野生型小鼠。 (4)分子机制探索:GSNOR通过降低海马区CamKⅡα的亚硝基化修饰,下调其在突触小体中的积累,同时抑制了下游GLUR1磷酸化修饰和CREB/c-fos信号通路,诱导小鼠学习记忆损伤。我们通过蛋白亚硝基化修饰定量组学方法检测GSNOR转基因小鼠的海马组织,发现目标靶点CamKⅡα的亚硝基化修饰显著降低。同时,我们通过对GSNOR转基因小鼠海马组织中一系列学习记忆关键蛋白转录水平,表达水平以及突触小体积累水平进行筛选实验,发现目标蛋白CamKⅡα在海马组织突触小体中的积累明显降低。接着,我们在原代培养海马神经元,转基因小鼠和自然衰老小鼠中证明GSNOR通过下调CamKⅡα的亚硝基化修饰,抑制CamKⅡα在突触小体中的积累,下调GLUR1磷酸化修饰和CREB/c-fos信号通路,从而损伤小鼠学习记忆能力。 (5)补充NO信号通路或者上调CamKⅡα/CREB信号通路可以挽回GSNOR转基因小鼠的学习记忆损伤。我们通过给GSNOR转基因小鼠注射一氧化氮合酶NOS底物L-Arginine补充NO信号通路以及注射激活剂Nobiletin上调CamkⅡα/CREB信号通路,结果证实这两种方法都可以挽回GSNOR转基因小鼠的学习记忆损伤。以上实验验证了GSNOR是通过下调NO信号通路,抑制CamkⅡα/CREB信号通路损伤小鼠学习记忆能力的分子机制,并暗示NO信号通路不足很可能是导致衰老相关认知功能损伤的重要原因。 综上所述,我们的研究确定了GSNOR是衰老相关认知功能损伤的新的潜在靶点,提出NO信号通路不足很可能是导致衰老相关认知功能损伤的重要原因。同时,我们还在体内首次证明了CamkⅡα的亚硝基化修饰的新机制,GSNOR可以通过下调CamkⅡα的亚硝基化修饰抑制其在突触小体中的积累。这些结果为减缓衰老相关认知功能损伤提供了潜在的新靶点和新策略。