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目的:研究大鼠肝星状细胞中Samd1、P-Smad1及纤维化相关基因E-cadherin、α-SMA、col1A2等的表达情况,探讨BMP-7在肝纤维化发生发展过程中如何拮抗TGF-β1,阐述其抗肝纤维化机制。 方法:(1) 体外培养大鼠肝星状细胞(HSC-T6),采用脂质体转染法将组成性激活化型BMP-7Ⅰ型受体突变体(ALK3-CA)的真核表达载体pcDNA3-HASL-ALK3转染HSC-T6,用逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)筛选克隆细胞株;(2) 四甲基偶氮唑盐[3-(4,5-Dimethyl-thiaoly)-2,5-diphenyl-2H tet razolium bromide, MTT]法检测高表达持续活化型ALK3后HSC-T6增殖;(3) RT-PCR检测col1A2 等基因的mRNA表达;(4)蛋白印迹(Western blotting,WB)法分别检测Samd1、P-Smad1、E-cadherin、α-SMA、col1A2的表达;高倍显微镜下观察高表达持续活化型ALK3克隆细胞株细胞形态。 结果:(1) RT-PCR结果表明阳性克隆株细胞的α-SMA、col1A2、col3A1、col4A2 mRNA表达水平明显下调,而E-cadherin水平上调。(2) WB结果表明阳性细胞株P-Smad1、E-cadherin表达水平升高,α-SMA、col1A2表达下降,Smad1未见明显改变,以β-actin作为内参照。(3) MTT法结果表明高表达持续活化型ALK3能抑制HSC-T6细胞增殖的速度。与0h相比,当培养24h时ALK3-16/T6和对照细胞3.1/T6增殖倍数分别为1.5和2.6倍;当培养48h时,对照细胞增殖倍数为4.3倍,而ALK3-16/T6细胞为1.7倍(*,P<0.05);随着时间的延长,ALK3-16/T6细胞增殖速度较对照细胞要慢(*,P<0.05)。因此高表达持续活化型ALK3受体后可抑制HSC-T6细胞的增殖,并且具有时间依赖性。(4) 倒置显微镜下,对照组3.1/T6细胞呈单层生长,细胞多呈梭形排列,胞质薄而透明,核椭圆;ALK3-16/T6细胞成多角形或蝌蚪形,胞质饱满,核圆大。 结论:成功获得高表达持续活化型ALK3克隆细胞株,运用实验室各种技术方法结果提示BMP-7通过增强Samd1磷酸化水平而竞争性拮抗TGF-β1致纤维化作用。BMP-7或者ALK3可作为临床治疗肝纤维化治疗和预防的潜在靶点。